Microbiology

HybriScan Rapid Test Systems


- Einführung
- Vorteil zu konventionellen Methoden und PCR
- Tabelle mit Vorteilen und Nachteilen über andere Nachweismethoden
- Prinzip der HybriScan-Methode
- Empfindlichkeit, Spezifität, Flexibilität und Anwendbarkeit
- Beispiel: HybriScan Listeria monocytogenes
- Produktliste der HybriScan Kits
- Referenzen
- HybriScan Abwasserkalkulator




Einführung: Schneller Nachweis, Identifikation und Quantifizierung von Mikroorganismen in Getränke, Nahrungsmittel und Wasser

 

Das neue HybriScan Testsystem, welches auf der Sandwich-Hybridisierung basiert, bietet einen schnellen, empfindlichen und zuverlässigen Weg Verderbsmikroorganismen und pathogenen Keime in Getränke, Nahrungsmitteln und Wasser nachzuweisen, identifizieren und quantifizieren. Es ist ideales System für die umfangreiche und zuverlässige Routinenkontrolle von Rohmaterialien und Konzentraten in allen Produktionsschritten bis hin zur Endkontrolle des Fertigproduktes. HybriScan ist ein einfacher und zeitsparender Test, der mit Standardlaborausrüstung durchgeführt werden kann. (siehe Bild 1).

Arbeitsablauf der HybriScan Testmethode

Bild 1: Arbeitsablauf der HybriScan Testmethode


 



Vorteil gegenüber konventionellen Nachweismethoden und PCR

 


HybriScan erspart markant Zeit und Arbeit gegenüber traditionellen Methoden. Die Methode hat auch Vorteile gegenüber PCR und real time PCR, welche zwar auch höchst empfindlich sind, aber anfällig gegenüber experimentellen Interferenzen, wie Template-Inhibierung durch ungenügende Aufreinigung [1], und die fehlende Quantifizierungsgenauigkeit aufgrund der Tendenzen assoziiert mit PCR und reverse Transkriptionsreaktionen (allgemein akzeptierte Fehler verbunden mit PCR). Im Gegensatz dazu ist der HybriScan-Methode beinahe unabhängig gegenüber Einflüssen von Probenmatrix und detektiert nur lebende Zellen. Sie erlaubt auch den Nachweis von nicht kultivierbaren Mikroorganismen. Tabelle 1 vergleicht vor und Nachteile der verschiedenen Methoden.

 

Vorteile von HybriScan gegenüber anderen Nachweismethoden

Methode Vorteil Nachteil
HybriScan
  • Detektiert nur lebende Zellen
  • minimale Interferenz durch Probenmatrix
  • höchst spezifisch
  • praktisch keine Kreuzreaktionen
  • einfaches Handling
  • kostengünstige Ausrüstung
  • quantitativ und qualitativ
  • hoher Probendurchsatz (96er-Mikrotiterplatte)
  • detektiert nicht-kultivierbare Organismen
  • keine Differenzierung von Serotypen und Subspezies.
  • Beschränktes Sondendesign (Ziel = rRNA)
PCR
  • hoher Probendurchsatz
  • empfindlich
  • quantitativ
  • keine tod/lebend Unterscheidung
  • Empfindlich auf Matrixeinflüsse (hoher Reinigungsaufwand)
  • Anfällig auf Polymerase-Inhibierung
ELISA
  • Differenzierung von Serotypen und Subspezies
  • hoher Probendurchsatz (96er-Mikrotiterplatte)
  • quantitativ und qualitativ
  • tiefe Empfindlichkeit
  • tiefe Spezifität, viele Kreuzreaktionen
  • langsame und teure Testentwicklung
Conventional cultivation-based methods
  • relativ günstig
  • einfach
  • spezifisch
  • meist akzeptierte Methode
  • zeitaufwendig (bis zu 10 Tage)
  • keine Detektion von nicht-kultivierbaren Organismen
  • tiefer Probendurchsatz
  • arbeitsaufwendig


 




Prinzip der HybriScan-Methode

 


Die HybriScan Methode basiert auf der Detektion von rRNA mittels Hybridisierung durch spezifische Markierungssonden und Detektionssonden (Bild 2). Sandwichhybridisierungstests aus unverarbeiteten Zellproben oder in Verbindung mit PCR wurden extensiv für die klinische Diagnostik von Nukleinsäurennachweis aus Bakterien [3, 9, 10] und Viren [11] eingesetzt. Die Spezifität wird durch die konservative und einzigartige rRNA-Sequenz als Zielmolekül erreicht. Ein markierte Sonde wird für die Immobilisierung der Zielsequenz auf eine feste Phase (beschichtete Mikrotitterplatte) eingesetzt. Eine weitere markierte Sonde wird eingesetzt um danach ein Enymkomplex zu binden und um optische Messwerte zu bekommen. Die Detektion erfolgt durch den Antikörper Enzymkomplex, der andockt und ein chromogenes Substrat umsetzt. Der Umsatz des Substrates wird photometrisch bei 450nm gemessen und mit Standards verglichen. Die HybriScan Software ermöglicht eine einfache und automatische Messung und Auswertung möglich.

Detektion von rRNA mittels Hybridisierung durch spezifische Markierungssonden und Detektionssonden

Bild 2: Prinzip des HybriScan Sandwichhybridisierungstests



Sensitivität, Spezifität, Flexibilität und Applikationen der HybriScan technology

 


Die Sandwichhybridisierung ist sehr empfindlich und detektiert bereits im Attomol-Berreich die Ziel-rRNA-Moleküle [2]. Das ideale Hybridisierungsziel von Bakterien und Hefen ist die rRNA, weil jede Zelle eine Vielzahl von Ribosomen mit rRNA enthält. Eine einzelne Zelle enthält also mehrere Tausend Kopien von der Ziel-rRNA-Sequenz, aber nur eine entsprechende DNA-Sequenz. Die Sandwichhybridisierung bietet auch eine hohe Empfindlichkeit in unaufgearbeiteten biologischen Materialien, da sie nicht anfällig auf Matrixinterferenzen ist. Bei Verwendung von spezifischen Sonden, erlaubt HybriScan einen flexiblen Nachweis von Mikroorganismen-Gruppen oder auch spezifischen Spezies. Die Methode ist in vielen analytischen Feldern anwendbar, inklusiv Monitoring des mikrobiologischen Gehalts von Bier, Wein, nicht-alkoholischen Getränken, Trinkwasser, diverse Nahrungsmittel und Abwasser. HybriScan identifiziert, detektiert und quantifiziert schnell und exakt viele wichtige pathogene Keime, inklusive Salmonella, Campylobacter, Listeria und Legionella etc. oder sogar die relevantesten Spezies wie Leginella pneumophila, Listeria monocytogenes etc. [3, 4, 5].



HybriScan Listeria monocytogenes: Schnelles und innovatives Testsystem

 

Einer der wichtigsten pathogenen Keime in Lebensmitteln ist Listeria monocytogenes (Bild 3), welcher eine Gesundheitsbedrohung in gekühlten Nahrungsmitteln mit langem Verfalldatum darstellt. [6] Listeriose verursacht durch Nahrungsaufnahme ist in den letzten Jahren dramatisch gestiegen, folge ist viele Spitalnotfälle und sogar Tote. Milch , Käse, Eis und Fleisch kontaminiert mit pathogenen Keim führten zu den letzten Listeriosenausbrüchen. [7] L. monocytogenes vermehrt sich sogar bei gekühlten Temperaturen und ist fähig über einen breiten pH-Range von 4.39 bis 9.40. Dies sind die wichtigsten Eigenschaften hinsichtlich der Lebensmittelsicherheit.

Image of Listeria monocytogenes colonies grown on PALCAM agar

Figure 3: Listeria monocytogenes Kolonien auf PALCAM-Agar. HybriScan Listeria monocytogenes erlaubt eine rasche Identifikation von verdächtigen Kolonien innerhalb einer Stunde.


Konventionelle kultivierungsbasierende Methoden um L. monocytogenes nachzuweisen, enthalten generell eine selektive Anreicherung, gefolgt von einer Kultivierung auf selektivem Medium, Isolierung und biochemische Identifikation. [8] Diese arbeitsintensive und zeitraubende Technik beansprucht mehrere Tage bis zum Resultat. Ebenfalls verglichen zu molekularen und immunologischen Methoden, geben kulturelle Methoden oft falsch-negative Befunde. HybriScan Listeria monocytogenes ist eine exzellente Alternative um die lang dauernde kultivierungsbasierende Methode zu ersetzen. Sie ist genau so zuverlässig und umfangreich wie die klassische Methode, aber erlaubt einen schnellen Nachweis und Quantifizierung mit Resultat erhältlich innerhalb von 48 Stunden. Die Spezies-spezifische Sonde erlaubt einen direkten Nachweis von L. monocytogenes und schliesst falsch-positive Befunde, verursacht durch andere Listeria-Spezies, aus. Und des weiteren sind verdächtige Kolonien innerhalb einer Stunde, mittels HybriScanI Identifikationskit und ohne weitere Kultivierung, identifiziert. Bild 4 zeigt die Validierungsresultate von HybriScan Listeria monocytogenes. Lebensmittelproben wurden mit der HybriScan Methode analysiert und mit der kulturellen Methode, gemäss § 64 LFGB verglichen. Fünf verschiedene Nahrungsmittelkategorien wurden getestet. Das Resultat der Validierung zeigte eine relative Genauigkeit von 99.2%, eine relative Spezifität von 98.5% und eine relative Empfindlichkeit von 99.6%. Zwei Versionen von Kits sind erhältlich HybriScanI Listeria monoytogenes wird für die sehr schnelle, empfindliche und ökonomische Identifikation von verdächtigen Kolonien von L. monocytogenes und HybriScanD Listeria monocytogenes wird für den Nachweis, die Identifikation und Quantifizierung von L. monocytogenes in verschiedenen Lebensmittelmatrix verwendet.

HybriScan-Kits sind ein Resultat aus einem Gemeinschaftsprojekt zwischen Sigma-Aldrich und Scanbec GmbH.


Validierung von HybriScan Listeria monocytogenes

Bild 4: Validierung von HybriScan Listeria monocytogenes. 355 Lebensmittelproben wurden analysiert und mit der kulturellen Methode, gemäss § 64 LFGB, verglichen. Die blauen Werte entsprechen L. monocytogenes positiv getesteten Lebensmitteln in jeder Kategorie. Die Validierung wurde gemäss ISO 16140:2003 (ASU L00.00-22) durchgeführt.



Produkte HybriScan Kits

 


Kat. Nr. Name alte Kat. Nr. Alter Name Reaktionen Add to Cart
Nachweis Kits
62533 HybriScanD Bier FS G 01 FastScan Bier 96
56917 HybriScanD Campylobacter - - - - 96
68301 HybriScanD Getränke FS G 02 FastScan Getränke 96
96343 HybriScanD E. coli FS F 05 FastScan E. coli 96
12838 HybriScanD Enterobacter sakazakii - - - - 96
59744 HybriScanD Lactobac FS G 04 FastScan Lactobac 96
16593 HybriScanD Legionella FS W 01 FastScan Legionella 96
07190 HybriScanD Legionella pneumophila FS W 02 FastScan Legionella pneumophila 96
55661 HybriScanD Listeria FS F 03 FastScan Listeria 96
49699 HybriScanD Listeria monocytogenes FS F 04 FastScan Listeria monocytogenes 96
55662 HybriScanD Salmonella FS F 01 FastScan Salmonella 96
02349 HybriScanD Gesamtkeimzahlbestimmung FS B 01 FastScan Gesamtkeimzahlbestimmung 96
04447 HybriScanD Abwasser Microthrix parvicella FS W 04 FastScan Abwasser Microthrix parvicella 96
78436 HybriScanD Abwasser Gesamtkeimzahlbestimmung FS W 03 FastScan Abwasser Gesamtkeimzahlbestimmung 96
61397 HybriScanD Hefe FS G 03 FastScan Hefe 96
Identifikations-Kits
79742 HybriScanI Brettanomyces FS I 09 FastScan Brettanomyces 48
19503 HybriScanI Candida albicans FS I 08 FastScan Candida albicans 48
76545 HybriScanI E. coli FS I 04 FastScan E. coli 48
75724 HybriScanI Lactobacillus brevis FS I 10 FastScan Lactobacillus brevis 48
80065 HybriScanI Lactobacillus buchneri FS I 12 FastScan Lactobacillus buchneri 48
86827 HybriScanI Lactobacillus lindneri FS I 11 FastScan Lactobacillus lindneri 48
49417 HybriScanI Legionella pneumophila FS I 06 FastScan Legionella pneumophila 48
77007 HybriScanI Leuconostoc FS I 13 FastScan Leuconostoc 48
49712 HybriScanI Listeria monocytogenes FS I 01 FastScan Listeria monocytogenes 48
42875 HybriScanI Megasphaera FS I 17 FastScan Megasphaera 48
33018 HybriScanI Pectinatus cerevisiiphilus FS I 16 FastScan Pectinatus cerevisiiphilus 48
73582 HybriScanI Pectinatus frisingensis FS I 15 FastScan Pectinatus frisingensis 48
67289 HybriScanI Pediococcus damnosus FS I 14 FastScan Pediococcus damnosus 48

 


Table 2: HybriScan-Produkte (HybriScanD = Detektionskit; HybriScanI = Identifikationskit)

 




Referenzen

 

  1. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 2000, 25, 169-193.
  2. Tenhunen, J.; Eloranta, J.; Kallio, A.; Soderlund, H. A solution hybridization method for quantification of mRNAs: determining the amount and stability of oncogene mRNA. Genet. Anal. Tech. Appl. 1990, 7, 228-233.
  3. Huhtamella, S.; Leinonen, M.; Nieminen, T.; Fahnert, B.; Myllykoski, L.; Breitenstein, A.; Neubauer, P. RNA-based sandwich hybridisation method for detection of lactic acid bacteria in brewery samples. J. Microbiol. Methods 2007, 68(3), 543-53.
  4. Leskela, T.; Tilsala-Timisjarvi, A.; Kusnetsov, J.; Neubauer, P.; Breitenstein, A. Sensitive genus-specific detection of Legionella by a 16S rRNA based sandwich hybridization assay. J. Microbiol. Methods 2005, 62(2), 167-79.
  5. Rautio, J.; Barken, KB.; Lahdenpera, J.; Breitenstein, A.; Molin, S.; Neubauer, P. Sandwich hybridisation assay for quantitative detection of yeast RNAs in crude cell lysates. Microb. Cell Fact. 2003, 2(1), 4-12.
  6. Mellefont, L.A.; McMeekin, T.A.; Ross, T. Effect of relative inoculum concentration on Listeria monocytogenes growth in co-culture. Int. J. Food Microbiol. 2008, 121, 157-168.
  7. McLauchlin, J. The relationship between Listeria and listeriosis. Food Control 1996, 7, 187-193.
  8. Donnelly, C.W. Detection and isolation of Listeria monocytogenes from food samples: implications of sublethal injury, J. AOAC Int. 2002, 85, 495-500.
  9. Casademont I, Bizet C, Chevrier D and Guesdon JL Rapid detection of Campylobacter fetus by polymerase chain reaction combined with non-radioactive hybridization using an oligonucleotide covalently bound to microwells. Mol Cell Probes 2000, 14, 233-240
  10. Chevrier D, Popoff MY, Dion MP, Hermant D and Guesdon JL Rapid detection of Salmonella subspecies I by PCR combined with non-radioactive hybridisation using covalently immobilised oligonucleotide on a microplate. FEMS Immunol Med Microbiol. 1995, 10(3-4), 245–501.
  11. Albretsen C, Kalland KH, Haukanes BI, Havarstein LS and Kleppe K Applications of magnetic beads with covalently attached oligonucleotides in hybridization: isolation and detection of specific measles virus mRNA from a crude cell lysate. Anal. Biochem. 1990, 189, 40-50
  12. Uyttendaele, M., De Troy, P., Debevere, J. Incidence of Salmonella, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and Listeria monocytogenes in poultry carcasses and different types of poultry products for sale on the Belgian retail market. Journal of Food Protection 1999, 62, 735–740.

 




HybriScan Abwasserkalkulator

 

Für die Abwasserkits (04447 HybriScanD Abwasser Microthrix parvicella, 78436 HybriScanD Abwasser Gesamtkeimzahl) bieten wir ein Exelfile zur Berechnung der Gesamtkeimzahl, der Microthrix Zellzahl und Verhältnis von Microthrix : Gesamtkeimzahl an.

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