Sample Preparation Review

¿Você se preocupa em como prepara sua amostra biológica?

Em estatística, resultados falsos positivos e falsos negativos ocorrem quando um resultado positivo corrobora a hipótese nula e o resultado negativo corrobora para não rejeitar essa hipótese.

Em amostras biológicas, como o plasma e sangue humano total, por serem muito complexas, algum tipo de preparação de amostra deve ser feito para minimizar que erros como esses ocorram acima de uma frequência pré-definida.

Por essa razão, há uma série de técnicas de preparação de amostras biológicas que foram desenvolvidas ao longo do tempo como: precipitação de proteínas (PPT), extração líquido-líquido (LLE), extração de fase solida (SPE) entre outras; mas a escolha do método a ser utilizado deve ser avaliada de acordo com as circunstâncias do método de análise escolhido.

Complexos biológicos podem conter um ou mais substâncias de matriz que, ocasionalmente, interferem na detecção de um analito alvo. Essas substâncias interferentes podem se ligar ao revelador e gerar um resultado positivo ou impedir e dificultar sua detecção, originando um resultado falso negativo. Além disso, o analito alvo pode estar em concentrações abaixo do limite de detecção ou ainda o fluido biológico em si pode ocasionar a deterioração, contaminação ou ser incompatível com o instrumento analítico. (Steen Honoré Hansen, at al, 2015).

Devido a todas essas variações, a validação de métodos bioanalíticos é empregada para determinar sua performance e evitar que resultados errados sejam reportados. Por exemplo, a quantidade de drogas e seus metabólitos em fluídos biológicos desempenha um papel central na avaliação e interpretação de dados como: biodisponibilidade, bioequivalência, farmacocinética e toxico cinética (Vinod P. Shah 1, 2007). Essa validação normalmente segue os guias das farmacopeias nacionais e tem suma importância para a medicina diagnóstica.

Um exemplo clássico dessa importância é a Proteína de Bence Jones.

Em 1845 Dr. Henry Bence Jones, um patologista inglês, recebeu uma amostra de urina de um paciente afetado por “Mollities Ossium”. Essa amostra foi enviada a Bence-Jones porque os testes físico-químicos da época haviam mostrado um comportamento desconhecido. A autopsia do paciente revelou lesões típicas de mieloma múltiplo (MacIntyre W , 1850).

Em 1847, Bence-Jones escreveu que as características físico-químicas particulares da amostra poderiam ser ocasionadas pela presença de uma proteína anômala, um “Deutosido Hidrato de Albumina” e por intuição sugeriu a busca por essa proteína em pacientes com suspeita clínica de “Mollities Ossium” (Bence Jones H., 1847 e Bence Jones H.  et al, 1847)

Bence-Jones havia descoberto o primeiro marcador tumoral. Em 1955, experimentos in vitro demonstraram que aminoácidos radioativos eram incorporados tanto nas proteínas de Bence-Jones (BJP) como nas proteínas mielomatosas. Em 1962 Edelman e Gally demonstraram que as cadeias leves (CL) obtidas das proteínas do soro de um mieloma de imunoglobulina G e as BJP tinham as mesmas características físico-químicas. Em 1966 e 1967 Putnam et al publicaram a sequência de aminoácidos da BJP e hoje estão demonstrados os seguintes pontos fundamentais (Massaro, 1992)

  1. Um sujeito normalmente apresenta cadeia leve livre (CLL) no sangue, na urina e no liquido cefalorraquidiano e é possível determina-las quantitativamente
  2. As CLL de um sujeito e as BJP são sintetizadas “de novo” e não se tratam de produtos da degradação das imunoglobulinas
  3. As BJP, as CLL e as CL das imunoglobulinas possuem a mesma identidade molecular em todos os líquidos biológicos
  4. As BJP e a CLL existem em forma de monômeros, dímeros e polímeros de maior peso molecular em todos os líquidos biológicos
  5. As BJP, as CLL e as CL das imunoglobulinas constituem um “pool” extremamente heterogêneo devido as variações estruturais que todas essas proteínas apresentam, tanto no sujeito normal como nos casos de patologias da produção.

Atualmente, tanto o soro quanto a urina devem ser analisados para pesquisa de proteínas monoclonais (Kyle RA, 1999). O objetivo da avaliação laboratorial é demonstrar a presença, a quantidade e o tipo de proteína anormal presente no soro e/ou na urina através do estudo do perfil protéico ou da quantificação das imunoglobulinas e cadeias leves bem como avaliação da proteinúria. Quando a banda representa uma cadeia leve livre monoclonal, a proteína correspondente é conhecida por proteína de Bence Jones (Attaelmannan, at al, 2000).

Para esse contexto em que amostras complexas precisam ser analisadas para a determinação e pesquisa de marcadores biológicos solúveis, a Merck disponibiliza a tecnologia AMICON®, que provê um rápido processamento e alta recuperação através da ultra-centrifugação.

A tecnologia utiliza a filtração tangencial para separar, concentrar e dialisar amostras biológicas de maneira rápida e eficiente. Permite ainda que análises downstream, como os estudos de atividade biológica e estrutural, onde é necessário garantir que as proteínas estejam em seu estado nativo e em sua forma solúvel seja preparada no solvente de escolha e na concentração apropriada.

 

Para aplicações clínicas é possível preparar as amostras, sem alterar o seu pH fisiológico, sua composição iônica ou a concentração de microssolutos não ligados, realizar:

  • Separação de moléculas livres de microssolutos ligados em soro, plasma e outras amostras biológicas;
  • Determinar drogas terapêuticas livres, como testosterona e tiroxina;
  • Ensaios de ligação;
  • Desproteinação;
  • Concentrar urina e liquido cefalorraquidiano para concentrar proteínas que indicam anormalidade ou estágios patológicos, como a Bence-Jones Protein

E para amostras não clínicas é possível:

  • Clarificar amostras DNA para aplicações forenses
  • Concentrar DNA genômico e proteínas
  • Dialisar e concentrar amostras biológicas

As tecnologias de preparo de amostras precisam acompanhar a tendência de aprimoramento dos equipamentos bioanalíticos cada vez mais complexos, sensíveis e informativos. Estamos preparados para atender essa nova realidade. Conheça mais em www.merckmillipore.com/amicon.

Bibliografia:

  1. Vinod P. Shah. The History of Bioanalytical Method Validation and Regulation (The AAPS Journal 2007; 9 (1) Article 5 (http://www.aapsj.org)
  2. Steen Honoré Hansen and Stig Pedersen-Bjergaard. Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample Preparation, Separation Techniques and Mass Spectrometry, First Edition.  2015 John Wiley & Sons, Ltd. Published 2015 by John Wiley & Sons, Ltd. 74 Bioanalysis of Pharmaceuticals
  3. Stig Pedersen-Bjergaard, Astrid Gjelstad and Trine Grønhaug Halvorsen Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample Preparation, Separation Techniques, and Mass SpectrometryPublished Online: 22 MAY 2015
  4. Bence Jones H. - On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Proc R Soc Lond, 1847, 5, 673
  5. Bence Jones H. Papers on chemical pathology. Lecture III. Lancet, 1847, 2, 88-92 4) MacNamara EM, Aguzzi F, Petrini C, Higginson J, Gasparro C. Bergami MR, Bianchi G, and Whicher JT. - Restricted Electrophoretic Heterogeneity of Immunoglobulin Light Chains in Urine: a Cause for Confusion with Bence Jones Protein. Clin Chem; 1991; 37, 1570-4
  6. MacIntyre W. - Case of mollities and fragilitas ossium, accompanied with urine strongly charged with animal matter. Med Chir Soc, 1850, 33, pp. 211 – 232
  7. Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies - serum and urine assays. Arch Pathol Lab Med 1999:123:114-8
  8. Massaro L. Catene Leggere Libere "pseudo-oligoclonali" in urine - Riflessioni indotte da recenti lavori. Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1213 – 1215
  9. Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and identifying monoclonal gammopathies. Clin Cem 2000;1.230-8.