Cultrex® 3-D Culture Matrix™ 低生长因子基底膜抽提物,PathClear®实验方案

I. 产品描述

3D细胞培养可为细胞提供必要的结构和信号指令来定向重建组织结构。这一类方法能够提供体外的生理性预期模型,帮助用户评估细胞的发育与疾病状态。正常细胞会聚集为结构类似其来源组织的类器官,进而表现出极化的形态,细胞周期调控现象并表达组织特异性的蛋白1-6。当癌症细胞聚集为肿瘤样结构时,则会基于其恶性程度,表现出组织性结构或细胞周期调控的缺乏,并表达出肿瘤特异性的标记物7-9

为了帮助用户最大程度地发挥本技术的优势,我们推出了Cultrex® 3-D Culture Matrix RGF BME产品,这款产品是首例基底膜抽提物产品,经过3D培养效果验证,专为满足三维培养研究的需求而研制,。3-D Culture Matrix RGF BME能够为细胞提供三维生长基础,帮助其在体外形成特定结构。为了提供最标准化的3D培养基底膜抽提物产品,采用一套特殊工艺来降低生长因子,并将基质的标准浓度控制在15 mg/ml左右,。随后在三维培养条件下对本品的效能进行了评估验证。

 

II. 规格说明

  1. 浓度:14 - 16 mg/ml。
  2. 来源:啮齿类Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤
  3. 储存缓冲液:不含酚红的DMEM培养基 (货号 D5030),10 μg/ml 硫酸庆大霉素 (货号 G1264

 

III. 未随附的必要试剂与仪器

1. 设备

  1.  层流罩
  2.  37 °C CO2 培养箱
  3.  用于收集细胞的低速旋转4 °C离心机与离心管
  4.  血细胞计数器或用于细胞计数的其它设备
  5.  -20 °C储存设备
  6.  冰桶
  7.  移液器与吸管辅助器
  8.  带有4X物镜与数字摄像机的明场显微镜

2. 试剂

  1.  感兴趣的细胞系
  2.  细胞收集缓冲液;EDTA,胰蛋白酶,或其他细胞解离缓冲液
  3.  组织培养生长培养基
  4.  培养基中可能需要添加的药理学试剂
  5.  用于润洗细胞的磷酸盐缓冲液 (货号 P5493
  6.  固定用福尔马林 (货号 F5554

3. 耗材

  1. Greiner培养瓶, TC处理,25 cm2 (货号 C6231)或75 cm2 (货号 C7106)规格
  2. Sigma® 离心管, 10 ml(货号 SIAL0790)与50 ml(货号 SIAL0828)规格
  3. Sigma® 血清学移液器,1,5和10 ml(货号 SIAL1485SIAL1487SIAL1488)规格
  4.  手套

 

IV. 注意事项与使用限制

  1. 仅用于研究用途,不适用于诊断操作流程。
  2. 这些产品的物理、化学和毒理学性质可能尚未经过充分研究;因此,我们建议用户在使用这些化学试剂的过程中佩戴手套、实验服和护目镜。

 

V. 材料鉴定

1. 功能检测

  1. 小管形成分析 - BME可促进人(HBMVEC、HUVEC)或小鼠(SVEC4-10)内皮细胞形成毛细管样结构。
  2. 3D培养 - 基底膜抽提物可促进乳腺(MCF-10A)或前列腺(PC-3)源人上皮细胞系的分化,进而形成腺泡结构。

2. 无菌检测

  1. PathClear®  –PCR检测显示支原体阴性;小鼠抗体生产(MAP)检测通常涵盖了17种细菌和病毒株检测,以及包括LDEV在内的13个附加鼠类感染源检测项目,合计检测31个物种/病毒。
  2. 根据USP无菌测试流程,在37 °C下孵育14天,未检测到细菌或病毒生长现象。
  3. LAL分析结果显示内毒素浓度≤8 EU/ml

3. 胶凝作用分析

  1. 在37 ⁰°C条件下,BME会在30分钟之内形成凝胶,并能在37 ⁰C下的培养基中至少维持14天凝胶状态。

 

VI. 储存与稳定性

于–20 ⁰C的手动除霜冰箱条件下保存时,产品可在发货后三月内保持稳定。如需获得更好的稳定性,请于–80 ⁰C条件下储藏。请避免反复冻融。

 

VII.3D培养方案

本方案需在层流柜或无菌室等洁净环境下进行,用户需使用无菌技术以避免污染。本实验方案基于Debnath 等的方法1 。该方法是经过充分验证的实例;不同的细胞系需要不同的细胞培养条件和孵育时长。

  1. 按照细胞供应商的建议培养细胞,以便在37 ⁰C的CO2 培养箱中形成稳定的细胞群;生长培养基,生长因子、血清要求和培养时长可能随细胞类型而变化;此处以MCF-10A(DMEM,5%马血清(HS),20 ng/ml hEGF,500 ng/ml氢化可的松,100 ng/ml霍乱毒素,10 μg/ml胰岛素,1X青霉素/链霉素)与PC-3(RPMI-1640,10% HS,5%胎牛血清(FBS)为例。
  2. 请在2-8 ⁰C条件下过夜解冻3-D Culture Matrix RGF BME。
  3. 在冰上进行操作,向无菌48孔板的每个反应孔中加入250 μl 3-D Culture Matrix RGF BME,在37 ⁰C条件下孵育平板30分钟以促进基质凝胶化。
  4. 在冰上进行操作,向无菌的培养容器中加入98 ml生长培养基(按照细胞供应商推荐的方法)与2 ml 3-D Culture Matrix RGF BME(终浓度为2%),并在容器上标记“Assay Media(分析培养基)”,然后旋转混匀。未用的3-D Culture Matrix RGF BME可在4 ⁰C条件下储存一周,或在-20°C手动除霜冰箱中(按工作用量)分装保存。
  5. 制备细胞稀释液之前,在37⁰C条件下孵育Assay Media(分析培养基)30分钟。
  6. 从培养物中采集细胞,并使用24 ml分析培养基将这些细胞稀释至1 x 104 细胞/ml。
  7. 向含有3-D Culture Matrix RGF BME的48孔板中加入细胞悬液,每孔500 μl。
  8. CO2 培养箱中,37 ⁰C条件下过夜孵育平板。
  9. 每天通过倒置显微镜观察细胞生长与结构形成情况,之后重新将48孔板放置于CO2 培养箱中37 ⁰C孵育过夜。
  10. 在第4天,用无菌的血清移液器小心吸去原培养基,并更换全新的Assay Media。在第8天和第12天重复此操作。
  11. 当团块结构生长至所需的大小后,制备分析用细胞(按照生产商的建议),并对其进行结构分析。这一采样时间点取决于所用的细胞系和生长条件。根据我们的标准,MCF-10A细胞应在第16天进行分析,PC-3细胞应该10-12天时进行分析。

分析建议

  1. 固定细胞时,在含2%福尔马林的1X PBS中室温孵育20分钟。
  2. 可在含有BME的平板中分析细胞;也可将其(非常小心地)转移至显微镜玻片上;或使用石蜡对样本进行包埋和切片。

Three-Dimensional Cellular Structures

图1. 三维细胞结构。在3-D Culture Matrix RGF BME中培养16天后,对MCF-10A细胞进行染色:A)细胞染色试剂盒(结构);B)SYBR® Green(细胞核);C)MitoShift(线粒体膜电位); 3-D Culture Matrix RGF BME中培养12天后,对PC-3细胞进行染色:D)Calcein AM(细胞活力);E)CPA染料1(细胞核);F)Depsipher(线粒体膜电位)

 

法律信息

3-D Culture Matrix is a trademark of Trevigen, Inc.

Cultrex and PathClear are registered trademarks of Trevigen, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Eugene OR

Depsipher and MitoShift are trademarks of Trevigen, Inc.

 

材料

     

参考文献

  1. Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. 2003. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. Jul; 30(3):256-68.
  2. Webber MM, Bello D, Kleinman HK, and Hoffman MP. 1997. Acinar differentiation by non-malignant immortalized human prostate epithelial cells and its loss in malignant cells. Carcinogenesis. 18(6): 1225-1231.
  3. Fong CJ, Sherwood ER, Sutkowski DM, Abu-Jawdeh GM, Yokoo H, Bauer KD, Kozlowski JM, and Lee C.1991. Reconstituted basement membrane promotes morphological and functional differentiation of primary human prostate epithelial cells. Prostate. 19(3): 221-235.
  4. Lang SH, Sharrard RM, Stark M, Villette JM, and Maitland NJ. 2001. Prostate epitheial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85(4): pp. 590-599.
  5. Taub, M, Wang Y, Szczesny T, and Kleinman H. 1990. Epidermal growth factor or transforming growth factor β is required for kidney tubulogenesis in matrigel cultures in serum-free medium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4002-4006.
  6. Kubota Y, Kleinman H, Martin G, and Lawley T. 1988. Role of laminin and basement membrane proteins in the morphological differentiation of human endothelial cells in capillary-like structures. J. Cell Biol. 107:1589-1598.
  7. Kenny, P.A., et al., 2007. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol Oncol, 1(1): p. 84-96.
  8. Harma, V., et al., A 2010. Comprehensive Panel of Three-Dimensional Models for Studies of Prostate Cancer Growth, Invasion and Drug Responses. PLoS ONE, 5(5): p. e10431.
  9. Fridman, R., G. Giaccone, T. Kanemoto, G. Martin, A. Gazdar, and J. Mulshine. 1990. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6698-6702.
  10. Ponce M., Nomizu M, Delgado M, Kuratomi V, Hoffman M, Powell S, Yamada Y, Kleinman H, and Malinda K. 1999. Identification of endothelial cell binding sites on the laminin g1 chain. Circ. Res. 84:688-694.
  11. Benton, G., J. George, H.K. Kleinman, and I.P. Arnaoutova. 2009. Advancing Science and Technology Via 3D Culture on Basement Membrane Matrix. J. Cell. Physiol. 221:18-25.
  12. Benton G, Kleinman HK, George J, Arnaoutova I. 2011. Multiple uses of basement membrane matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with tumor cells. Int. J. Cancer. 128 (8); 1751-1757.