DNA损伤与修复

DNA损伤与修复机制

突变与癌症的发生均包含细胞DNA损伤过程。人类细胞中的DNA每天都会由于外部(外源)和内部(内源)的代谢进程而遭受成千上百次损伤。细胞基因组的改变可能导致DNA转录过程出现错误,进而通过翻译过程影响到信号转导和细胞功能必需的蛋白质。如果有丝分裂之前这些基因组突变尚未完成修复,则还会进一步遗传给子代细胞。一旦细胞丧失了有效修复DNA损伤的能力,就可能发生三种反应:细胞衰老、细胞凋亡和细胞癌变(参见图1)。

  1. 细胞可能会衰老,即进入不可逆的休眠状态。2005年,多家实验室报道癌症细胞在体内和体外均会发生衰老现象,停止有丝分裂,阻止细胞进一步演化1-4
  2. 细胞可能发生凋亡。DNA损伤达到一定程度,就可能触发一条凋亡信号转导通路,迫使细胞进入程序性细胞死亡过程。
  3. 细胞可能会恶变,即出现永生化的性质并开始不受控制地分裂。

图1. 可能引起衰老、凋亡或癌变的细胞DNA损伤与修复的通路

 

为了代偿细胞内可能发生的不同程度和类型的DNA损伤,细胞发展出多种不同的修复机制,包括错配、碱基切除,以及核苷酸切除修复机制。不同修复机制之间很少出现冗余处理。如果出现损伤过度,细胞就不再耗费能量来有效修复损伤之处,而很可能发展为凋亡或衰老。细胞能够有效修复的比例与细胞类型核细胞年龄等因素息息相关。
 

DNA损伤的来源

多年来,外源性损伤一直被认为是致癌DNA突变的首要来源。不过,Jackson与Loeb提出内源性DNA损伤也可能是致癌突变的重要来源5 。来自环境与细胞的诱因均可导致相似类别的DNA损伤。

DNA会受到物理与化学诱变剂的影响。物理诱变剂主要源自各种放射源,其中包括太阳的紫外线(200-300 nm波长)。紫外线会生成共价键,将DNA链中相邻的嘧啶(胞嘧啶与胸腺嘧啶)碱基交联起来。电离射线(X射线)会在细胞中产生自由基,这些自由基会制造活性氧(ROS)并导致双螺旋中的单链或双链断裂,从而引发DNA突变。化学诱变剂能够攻击DNA碱基上共价结合的烷基基团;能够促使DNA碱基发生甲基化或乙基化反应的氮芥类化合物即是DNA烷化剂的一个实例。前致癌物为一类化学惰性的前体物质,能够通过代谢反应转化为具有高度活性的致癌剂。这些致癌剂能够与DNA发生反应,形成DNA络合物,即附着在DNA之上的化学实体。苯并芘为一类多芳烃的杂环类物质,本身并非致癌物。但它可通过由细胞色素P450酶介导的两个连续氧化反应,生成苯并芘二醇环氧化物(BPDE),后者则是一种致癌代谢物,能够介导共价DNA络合物的形成(参见图2)。

图2. 苯并芘被P450酶所氧化,生成具有高度致癌性的苯并芘二醇环氧化物。

 

内源代谢和生化反应也可能造成DNA损伤,但人们对其中的一些机制还知之甚少6。水解反应可能部分或彻底切割DNA链上的核苷酸碱基。连接嘌呤碱基(腺嘌呤或鸟嘌呤)与脱氧核糖磷酸链的化学键可能在脱嘌呤过程中自发断裂。哺乳动物细胞中每天发生约10000次脱嘌呤活动7。脱嘧啶活动(在胸腺嘧啶或胞嘧啶的位置丢失嘧啶类碱基)也可能发生,但频率要比脱嘌呤活动低20~100倍。

细胞中也会发生脱氨作用,即腺嘌呤、鸟嘌呤与胞嘧啶环上的氨基丢失,分别形成次黄嘌呤、黄嘌呤与尿嘧啶。DNA修复酶能够识别和纠正这些非天然的碱基,但未被纠正的尿嘧啶碱基在后续的DNA复制过程中可能会被误读为胸腺嘧啶,随之形成C→T点突变。

在细胞内,与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的反应可以介导DNA甲基化(一种特殊的烷化作用)。SAM是一类细胞内代谢中间体,包含一个具有高度活性的甲基基团。在哺乳动物细胞中,甲基化发生在胞嘧啶碱基的胞嘧啶环5号位置上,进而形成了一个鸟嘌呤碱基,即序列CpG。突变错误的一个重要来源是甲基化产物5-甲基胞嘧啶的自发脱氨基作用。氨基丢失导致形成胸腺嘧啶碱基,从而无法被DNA修复酶识别为异常碱基。这一碱基置换作用在DNA复制过程中被保留,形成C→T点突变(参见图3)。

图3. 胞嘧啶的两阶段突变导致产生胸腺嘧啶,进而形成了C→T点突变。

 

正常的代谢进程会生成活性氧(ROS),后者会通过氧化作用修饰DNA碱基。嘌呤与嘧啶类碱基均会受到氧化作用的影响,最为常见的突变是鸟嘌呤被氧化为8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤,形成8-氧代脱氧鸟苷(8-oxo-dG)。8-oxo-dG能够与脱氧腺苷而非预期的脱氧胞苷相配对。如果这一错误未被错配修复酶识别并纠正,则随后复制出的DNA产物就会包含一个C→A点突变。ROS也可能会介导脱嘌呤、脱嘧啶作用以及DNA单/双链的断裂。

在细胞周期S期,DNA复制过程中还可能引入其他类型的基因组突变。复制模板DNA的聚合酶有少量但不可忽视的错误率,会将错误碱基按照沃森-克里克配对原则整合进合成链中,与模板DNA相配。化学上发生改变的核苷酸前体也可能被聚合酶整合进入DNA合成链,代替正常碱基。此外,聚合酶在复制含有大量重复核苷酸或重复序列(微卫星区域)的DNA区段时,容易发生“打滑(stuttering)”现象。这一“打滑”的酶学现象是由于链之间发生滑动所致,此时模板与复制链之间可能出现的滑动会导致两者之间难于对准。其结果是聚合酶不能准确插入模板DNA指定数量的核苷酸,导致子链中的核苷酸过多或过少。

单链与双链DNA可能发生断裂。单链断裂可能由DNA脱氧核糖磷酸酯链上的脱氧核糖基团损伤引起。断裂也可能发生在碱基切除修复途径中AP-内切酶1去除脱氧核糖磷酸基团之后的一个中间步骤8。发生单链断裂后,核苷酸碱基与脱氧核糖骨架都会从DNA结构中丢失。双链断裂经常出现在细胞通过S期传代过程中,此时DNA发生解螺旋并成为复制的模板,因此更容易发生断裂。
 

DNA修复机制

当细胞有能力进入凋亡或衰老状态时,这些细胞活动都可视为细胞做出的最后调整。对于任一种类的DNA损伤而言,细胞都进化出特定的方法来针对性地修复,或清除损伤类化合物。

O6-甲基化鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT;DNA烷基转移酶)能够从DNA的鸟嘌呤碱基结构上剪切甲基和乙基加合物。这一反应并非催化(酶学)反应,而是化学计量(化学的)反应,每去除一个加合物,就消耗一个MGMT分子。经过基因工程改造而过表达MGMT的细胞对于癌症具有更强的耐受性,这很可能是因为它们能够消除大量的烷化损伤。Niture等人最近的一篇研究表明,使用半胱氨酸/谷胱甘肽促进药物与天然抗氧化剂可提升MGMT的表达水平9

聚合酶-δ等含有校正活性的DNA聚合酶主要参与复制易错性修复。当检测到错误时,这些酶会暂停DNA的复制过程,回头去除DNA子链上的核苷酸,直至错误掺入的核苷酸消除后,再重新开始正向的复制过程。对Pold1基因双拷贝点突变小鼠的研究数据表明,相对于野生型或单拷贝突变小鼠,此类小鼠的DNA聚合酶-δ校准活性缺失,且上皮性肿瘤发病几率明显上升10

错配切除修复(MMR)酶能够进一步纠正复制过程中DNA聚合酶校正活性未检测到的错误。MMR酶能够切除子链DNA上的错误核苷酸,并将母链DNA作为正确的模板,通过W-C配对来修复该链11 。这一修复过程对于复制微卫星区域时所产生的错误至关重要,因为DNA聚合酶的校正活性不会检测出此类错误。在有限程度内,MMR酶类还能够纠正由DNA氧化或烷化所导致的多种碱基对异常。这些突变包括含有O6甲基化鸟嘌呤与8氧鸟嘌呤的修饰碱基对,以及致癌剂和顺式铂氨加合物12,13。人类错配切割修复基因MSH2和MLH1的突变与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)综合症有关14
 

碱基切除修复与核苷酸切除修复

碱基切除修复(BER)过程涉及多种可切割和替换单一损伤核苷酸碱基的酶。由内源氧化和水解作用所引发的不良碱基修饰主要通过BER酶进行修复。DNA糖基化酶能够切割核苷酸碱基与核糖之间的化学键,释放完整的DNA核糖磷酸链,不过这一过程会形成一个无嘌呤或无嘧啶(AP)位点。8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶I(Ogg1)能够去除7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxoG),后者是一种由活性氧介导生成的碱基突变。人类OGG1基因的多态性与肺癌和前列腺癌等多种癌症患病风险相关。尿嘧啶DNA糖基化酶(另一种BER酶)能够切除胞嘧啶脱氨作用的尿嘧啶产物,防止之后形成C→T点突变15。N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)能够去除大量发生了修饰的嘌呤碱基16

由BER酶介导生成以及源自脱嘧啶和脱嘌呤作用的DNA AP位点,可被AP-内切酶1(APE1)修复。APE1能够切割AP位点上的磷酸二酯链的5'位置。这样DNA链就出现了一个3'-羟基基团与一个5'-碱性脱氧核糖磷酸基团。DNA聚合酶β(Polβ)基于相应的W-C配对原则向DNA链中插入正确的核苷酸,并通过其相应的AP水解活性去除脱氧核糖磷酸基团。X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)的存在对与III型DNA连接酶(LIG3)形成异源二聚体是必需的。支架蛋白XRCC1含有一个Polβ的非活性结合位点,从而将Polβ与LIG3酶一同带到修复位点17。与XRCC1和Polβ相互作用的Poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)是BER途径的必要组成部分18,19。修复的最后步骤由LIG3来完成,它将替代核苷酸的脱氧核糖基团与脱氧核糖磷酸骨架连接起来。这一途径被称为“短补丁BER” 20

另一条称为“长补丁BER”的替代途径能够置换最短2nt的核苷酸链。有报道表明该途径能置换10-12nt长度的核苷酸链21,22。长补丁BER需要增殖细胞核抗原(PCNA),后者能够作为重组酶的支架蛋白23。其他类型的DNA聚合酶(可能包括Polδ和Polε 24 )用于形成寡核苷酸瓣状结构侧翼。已有的核苷酸序列被瓣状核酸内切酶1(FEN1)所移除。寡核苷酸随后由DNA连接酶I(LIG1)连接至DNA上,填补缺口并完成修复工作17。有关短补丁与长补丁BER途径选择的确切细胞学机制仍处于研究阶段(参见图425

图4. 短补丁和长补丁BER途径原理图。

 

尽管BER可通过长补丁途径替代多个核苷酸,但短补丁与长补丁BER都是由单核苷酸损伤引发的,从而最大程度减少对DNA双螺旋结构的影响。核苷酸切除修复(NER)能够修复含至少两个碱基的核苷酸链损伤的,进而造成DNA结构的变形。除了修复较大DNA加合物和紫外线等引起的一系列外源性损伤外, NER还用于修复单链断裂26。 NER途径也可能用于修复氧化应激所致的损伤27。在哺乳动物细胞中,20多种蛋白参与了NER途径,其中包括XPA、XPC-hHR23B、复制蛋白A(RPA)、转录因子TFIIH、XPB与XPD DNA解旋酶、ERCC1-XPF和XPG、Polδ、Polε、PCNA和复制因子C28。在非小细胞肺癌细胞中,切除修复交叉互补(ERCC1)基因的过表达与细胞的顺铂耐受性有关29 ,ERCC1基因过表达的细胞也具有增强的DNA修复能力30。全基因组NER(GGR)能够修复整个基因组内发生的损伤,而特异性NER途径“转录偶联修复(TCR)”能够在活性RNA聚合酶进行转录的过程中对基因进行修复。31
 

双链断裂修复

DNA分子中的双链断裂会导致基因组序列丢失和重排。此类断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR),也称重组修复或模板辅助修复来进行修复。

当细胞处于S/G2阶段后期时,HR途径激活,模板被复制。这一机制基于与受损DNA区域通过着丝粒相连着一条相同或近乎相同的序列,该序列将作为修复模板。HR机制修复的双链断裂通常出现在复制机器试图通过一个单链断裂或非配对的位点,此时复制叉结构会出现折叠。

在细胞循环的其他节点,当姊妹染色单体不能作为HR模板时,细胞也可能启动非同源末端连接(NHEJ)机制。与HR途径不同,当这些断裂位点出现时,没有相应的模板链可供参考,细胞不再复制断裂的DNA区域。在NHEJ途径中,Ku异源二聚体蛋白位于两条断裂DNA链的末端位置,在没有模板指引的条件下对其进行修复,因此可能会丢失序列信息。多种酶类参与了重连过程,其中包括连接酶IV,XRCC4与DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)32,33。NHEJ具有内在的致突变性,因为这一机制有赖于两条需要连接的DNA片段的单链尾之间的偶然性配对(称为微同源,microhomologies)(参见图5)。在高等真核生物中,DNA-PK对于NHEJ修复是必需的,无论是主要机制还是替代性的备选机制(D-NHEJ)均是如此34

图5. NHEJ修复DNA双链断裂的常规机制

 

未来的应用

虽然DNA损伤是癌症细胞发生发展的关键因素,持续性损伤却是临床癌症治疗的组成部分,用于迫使恶性细胞进入凋亡或衰老进程。此种疗法中,博来霉素、丝裂霉素、顺铂等诸多化疗药物都很有效,因为它们能够让比周围组织复制更快的癌症细胞发生进一步的DNA损伤。细胞DNA修复机制是一把双刃剑:一方面它可以减少致癌突变从而帮助保持基因组的完整性;而在恶性细胞中,同样的机制却让细胞幸免于更多的DNA损伤以及持续发生不可控的生长。为了阻断癌症细胞中的这一存活机制,人们正尝试使用特定的DNA修复酶(包括MGMT、PARP和DNA-PK)的抑制剂来开展临床实验35-38
 

材料

     

参考文献

Based on BioFiles 2007, 2.4, 20.

  1. Collado, M., et al., Nature, 436, 642 (2005).
  2. Chen, Z., et al., Nature, 436, 725 (2005).
  3. Michaloglou, C., et al., Nature, 436, 720 (2005).
  4. Braig, M., et al., Nature, 436, 660 (2005).
  5. 5Jackson, A.L., and Loeb, L.A., Mutat. Res., 477, 7-21, (2001).
  6. De Bont, R., and van Larebeke, N., Mutagenesis, 19, 169-85 (2004).
  7. Lindahl, T. and Nyberg, B., Biochemistry, 11, 3610-3618 (1972).
  8. Brem., R. and Hall, J., Nucleic Acids Res., 33, 2512-2520 (2005).
  9.  Niture S.K., et al, Carcinogenesis, Epub ahead of print (Aug. 31, 2006)
  10. Goldsby, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15560 (2002).
  11. Yang, W., Mutat. Res., 460, 245-56 (2000).
  12. Iyer, R.R., et al., (Review), Chem. Rev., 106, 302-23 (2006).
  13. Modrich, P., J. Biol. Chem., 281, 30305-30309 (2006).
  14. Muller, A. and Fishel, R., Cancer Invest., 20, 102-9 (2002).
  15. Lindahl, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3649-3653 (1974).
  16. Singer, B., and Hang, B., Chem. Res. Toxicol., 10, 713-32 (1997).
  17. Lindahl, T. and Wood, R.D., Science, 286, 1897-1905 (1999).
  18. Caldecott, K.W., et al., Nucleic Acids Res., 24, 4387-4394 (1996).
  19. Dantzer, F., et al., Biochemistry, 39, 7559-7569 (2000).
  20. Srivastava, D.K., et al., J. Biol. Chem., 273, 21203-9 (1998).
  21. Ranalli, T.A., et al., J. Biol. Chem., 277, 41714-41724 (2002).
  22. Sattler, U., et al., EMBO Reports, 4, 363-367 (2003).
  23. Fortini, P., et al., Biochemistry, 37, 3575-3580 (1998).
  24. Klungland, A. and Lindahl, T., EMBO Journal, 16, 3341-8 (1997)
  25. Sung, J.S. and Demple, B., (Review), FEBS Journal, 273, 1620-1629 (2006).
  26. Balajee, A.S. and Bohr, V.A., Gene, 250, 15-30 (2000).
  27. Gros, L., et al., Oncogene, 21, 8905-8925 (2002).
  28. You, J.S., J. Biol. Chem., 278, 7476-7485 (2003).
  29. Rosell, R., et al., Cancer Control, 10, 297-305 (2003).
  30. Vogel, U., et al., Mutat. Res., 461, 197-210 (2000).
  31. Hanawalt, P.C., Oncogene, 21, 8949-8956 (2002).
  32. Critchlow, S.E. and Jackson, S.P., Trends Biochem. Sci., 23, 394-398 (1998).
  33. Wang, H., et al., Nucleic Acids Res., 31, 5377-88 (2003).
  34. Perrault, R., et al., J. Cell. Biochem., 92, 781-794 (2004).
  35. Sanchez-Perez, I., Clin. Transl. Oncol., 8, 642-6 (2006).
  36. Madhusudan, S. and Hickson, I.D., Trends Mol. Med., 11, 503-11 (2005).
  37. Plummer, E.R., Curr. Opin. Pharmacol., 6, 364-8 (2006).
  38. Sabharwal, A. and Middleton, M.R., Curr. Opin. Pharmacol., 6, 355-63 (2006).