分析用試薬/溶媒

HPCE

キャピラリー電気泳動用試薬

HPCE バッファー

IEF Markers

Anion HPCE-Kit

有機モディファイヤー

両性電解質

 

HPCE Buffers

Introduction

近年、キャピラリー電気泳動(HPCE)システムの発展により高品位試薬を使用する必要性が求められるようになりました。弊社ではHPCEを扱う多くのお客様の要求に応えるために、2.5~11pHの領域をカバーする一連の調製済みバッファーを提供しています。

品質保証

以下の内容に基づき製造と管理をしています。

  • 不溶性の不純物を含みません - HPCEバッファは0.2μmのフィルターでフィルトレーションされています。
  • 広波長範囲にわたる最小量の吸収 - 以下 figure 1参照
  • 蛍光性不純物 - 以下 figure 2参照
  • アプリケーションのテスト - 以下 figure 3参照
Figure 1 - HPC Electrophoresis: UV/VIS absorption of the buffer solution pH 2.5 for HPCE in the wave-length range 200-800 nm.

Figure 1: HPCE用 pH2.5のバッファー溶液(CAT.NO.82581)における波長範囲200-800nm中のUV/VIS吸収
Figure 2 - HPCE Electrophoresis: Residual fluorescence of the buffer solution pH 2.5 for HPCE

Figure 2: HPCE用 pH2.5のバッファー溶液(CAT.NO.82581)の残留蛍光。蛍光は200、230、260nmで励起光によりチェックされます。これは、蛍光検出でのアプリケーションのためにこのバッファーの優れた適合性を例証します。 スタンダード(S):10-7M オバレン、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)マトリックスに包埋、excited at 342 nm。
Figure 3 -HPCE Electrophoresis: Separation of the twopeptides aprotinin (A ) and soybean trypsin inhibitor (STI ).

Figure 3: 2つのペプチド、アプロチニン(A)と大豆トリプシンインヒビター(STI)の分離。サンプル:それぞれのペプチドを50ng/mL含んでいます。分離バッファ:pH2.5のクエン酸ナトリウム(CAT.NO.82581)20nm。キャピラリーフューズドシリカ(溶融石英)、長さ60cm、0.5mm I.D.。Injection:静水3秒、DH =9.8 cm。 Field: 20 kV. Detection: 200 nm

製品リスト: HPCEのためのバッファー溶剤

CAT.NO. Description Package Size
82581 HPCE用バッファー溶液pH 2.5
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82635 HPCE用バッファー溶液pH 2.5
[50 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82578 HPCE用バッファー溶液pH 2.5
[100 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82582 HPCE用バッファー溶液pH 3.0
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82621 HPCE用バッファー溶液pH 3.0
[ 酸化第二銅の電解質バッファー pH 3.0]
陽イオン検出用 (アルカリ、アルカリ土類金属、およびアミン)
50 mL/100 mL 
82622 HPCE用バッファー溶液pH 3.0
[150 mM potassium phosphate, リン酸カリウム]
100 mL/500 mL
82599 HPCE用バッファー溶液pH 3.0
[100 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82583 HPCE用バッファー溶液pH 3.5
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82584 HPCE用バッファー溶液pH 4.0
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82585 HPCE用バッファー溶液pH 4.5
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82586 HPCE用バッファー溶液pH 5.0
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82587 HPCE用バッファー溶液pH 5.5
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82588 HPCE用バッファー溶液pH 6.0
[20 mM sodium citrate, クエン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82589 HPCE用バッファー溶液pH 6.5
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82591 HPCE用バッファー溶液pH 7.0
[20 mM borate-phosphate, リン酸ホウ酸塩]
50 mL/100 mL/500 mL
82614 HPCE用バッファー溶液pH 7.0, SDS入り
[100 mM boric acid/50 mM sodium phosphate, with 50 mM SDS]
special quality for Micellar Electrokinetic CapillaryChromatography (MECC)
50 mL/100 mL 
82636 HPCE用バッファー溶液pH 7.0
[50 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82637 HPCE用バッファー溶液pH 7.0
[100 mM sodium citrate], クエン酸ナトリウム
50 mL/100 mL
82592 HPCE用バッファー溶液pH 7.5
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82619 HPCE用バッファー溶液pH 7.7
[ピロメリット酸電解質バッファー pH 7.7]
無機と低分子量機酸アニオンイオンの検出用
50 mL/100 mL 
82593 HPCE用バッファー溶液pH 8.0
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82594 HPCE用バッファー溶液pH 8.0
[20 mM sodium tetraborate, 四ホウ酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82615 HPCE用バッファー溶液pH 8.0, メチルセルロース入り
[50 mM TRIS-borate/ 2.5 mM EDTA, 0.5% methylcellulose]
special quality for separation of DNA restrictions fragments
50 mL/100 mL 
82633 HPCE用バッファー溶液pH 8.0
[50 mM sodium borate, ホウ酸ナトリウム]
50 mL/100 mL
82634 HPCE用バッファー溶液pH 8.0
[100 mM sodium borate, ホウ酸ナトリウム]
100 mL/500 mL
82601 HPCE用バッファー溶液pH 8.5
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82602 HPCEHPCE用バッファー溶液pH 8.5
[20 mM sodium tetraborate, 四ホウ酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82616 HPCE用バッファー溶液pH 8.6, 尿素入り
[100 mM TRIS/100 mM boric acid/2 mM EDTA/7 M urea]
核酸の分離用
50 mL/100 mL 
82603 HPCE用バッファー溶液pH 9.0
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82604 HPCE用バッファー溶液pH 9.0
[20 mM sodium tetraborate, 四ホウ酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82605 HPCE用バッファー溶液pH 9.5
[20 mM sodium phosphate, リン酸ナトリウム]
50 mL/100 mL/500 mL
82606 HPCE用バッファー溶液pH 10.0
[20 mM CAPS(3-(cyclohexylamino)-1-propane sulfonic acid)]
50 mL/100 mL/500 mL
82607 HPCE用バッファー溶液pH 10.5
[20 mM CAPS(3-(cyclohexylamino)-1-propane sulfonic acid)]
50 mL/100 mL/500 mL
82608 HPCE用バッファー溶液pH 11.0
[20 mM CAPS(3-(cyclohexylamino)-1-propane sulfonic acid)]
50 mL/100 mL/500 mL
82617 HPCE用バッファー溶液pH 11.0
[20 mM glycine-NaOH]
50 mL/100 mL
84428 HPCE用塩酸溶液 100 mL/500 mL
72079 HPCE用水酸化ナトリウム溶液 100 mL/500 mL
95283 HPCE用超純水 250 mL/1 L

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IEF マーカー

Application

IEF(等電点電気泳動)は、両性電解質、主にタンパク質の分離のための強力な分析ツールです。確実な高性能の分析を実施するためには、plのスタンダード(plマーカー)が必要です。典型的なタンパクベースのスタンダードに加え、低分子化合物が開発され、キャピラリーIEFやIEF-ゲル電気泳動で試験されました。キャピラリーIEFにとって、UV吸収は最も一般的な方法です。誘導化されたタンパク質は蛍光放出を引き起こします。たとえばダンシルクロリド、フルオレスカミン、o‐フタルジアルデヒドまたはクマリン成分などは感度を増加させる誘導体化試薬として用いられます。蛍光IEFマーカーを使うIEFゲル電気泳動にとっての別の利点は、染色することなく(UV照明を使用する)勾配の構成をコントロールすることが可能であるということです。

蛍光IEFマーカーの信号は蛍光検出ほど強くはありませんが、280 nm (20℃)でのUV吸収によって検出することができます。それぞれのマーカーの最大吸収波長は308~350nmです。蛍光検出における個々のマーカーの最大励起波長は310~400nmであり、最大発光波長は410~500nmです。

製品概要

Solids(固体):

  • 1 mg 入り
  • 蛍光発光: Emmax and Exc. (see table 1)
  • 保管温度; 4°C

Stock Solution(原液):

  • 200 μL 入り
  • 蛍光発光: Emmax, Exc. and conditions (see table 1)
  • マーカー濃度: 1, 2, or 3 mg /mlL
  • 溶液: 超純水他 (see table 1)
  • 0.45 mm のメンブランフィルターでフィルトレーション済み
  • 保管温度; 4°C (有効期限6ヶ月)

解析条件

  • Capillary: neutral capillary
  • Anolyte: 91 mM phosphoric acide in gel buffer
  • Catholyte: 20 mM sodium hydroxide in water
  • Detection: 280 nm
  • Temperature: 20 °C
  • Injection: 20 psi, 1 min
  • Polarity: inlet anode, outlet cathode
  • Focussing voltage: 500 V/cm
  • Focussing time: 2 min
  • Mobilization: 0.5 psi, 500 V/cm anolyte -> catholyte (Mobilization should be stopped after the last marker is eluted to avoid the filling of the capillary with anolyte.)

Example for CE-IEF with fluorescent pI Markers

Figure 4. 蛍光pIマーカーとCE-IEFの例

pI マーカー:
Peak 1: 8.7
Peak 2: 7.6
Peak 3: 6.6
Peak 4: 6.2

The emission spectrum and emission maximum of the Fluorescent IEF-Marker pI 7.6

Figure 5. 蛍光IEF-マーカーpl 7.6の蛍光スペクトルと最大蛍光波長

The UV spectrum of the Fluorescent IEF-Marker pI 7.6 (three different concentratio)

Figure 6. 蛍光IEF-マーカーpI 7.6(3つの異なる濃度)のUVスペクトル

Table 1. 蛍光IEFマーカー原液のコンディション

Additional information on Fluorescent IEF Markers in chapter Fluorescent Probes.

CAT.NO. 製品概要 pl Stock Solution の超純水と添加物濃度 Fluorescence, 蛍光発光
Marker [mg/ml] HCl [mM] 2-propanol (%) Emmax [nm] Exc. [nm] 測定のためのバッファー pH=pl
35096 solid (固体) 2.1 3 - 50 430 340 50mM Citrate, 50mM KCl
74169 stock solution(原液)
17952 solid (固体) 3 2 5 50 440 360 0.1M Citrate
72172 stock solution(原液)
17953 solid (固体) 3.5 2 5 50 415 318 0.1M Citrate
17954 solid (固体) 4 1 - - 415 310 0.1M Citrate
89827 stock solution(原液)
17955 solid (固体) 4.5 1 5 - 424 336 0.1M Citrate
89149 stock solution(原液)
17956 solid (固体) 5.1 2 10 - 415 330 0.1M Citrate
89478 stock solution(原液)
17957 solid (固体) 5.5 3 15 - 412 325 0.1M Citrate
77866 stock solution(原液)
17958 solid (固体) 6.2 1 10 - 500 394 0.1M Phosphate
73938 stock solution(原液)
17959 solid (固体) 6.6 1 10 - 500 396 0.1M Phosphate
73376 stock solution(原液)
17961 solid (固体) 6.8 1 5 - 418 338 0.1M Phosphate
89508 stock solution(原液)
17962 solid (固体) 7.2 1 4 - 500 387 0.1M Phosphate
89951 stock solution(原液)
17963 solid (固体) 7.6 1 10 - 495 385 0.1M Tris
89952 stock solution(原液)
17964 solid (固体) 8.1 3 - - 420 340 0.1M Tris
75734 stock solution(原液)
17966 solid (固体) 8.7 1 10 - 500 390 0.1M Tris
89357 stock solution(原液)
17967 solid (固体) 9 1 10 - 495 385 0.1M Tris
90699 stock solution(原液)
46276 solid (固体) 9.5 3 8 - 415 325 0.1M Carbonate
89268 stock solution(原液)
17968 solid (固体) 10.3 1 10 - 495 388 0.1M Carbonate
77672 stock solution(原液)
17951 stock solution of Marker-Mix - 2 (of each) 5 50 - - -

蛍光 IEF-Markers の使用方法

蛍光IEF-マーカーの使用手順は下記の通りです。

Table1を参考に、対象の試薬(sold)を溶かし、IEFマーカーの原液(stock solution)を用意してください。必要であれば最大10分間、超音波処理をします。4℃で保管します(原液はおよそ6ヶ月間、安定しています)。HPCEに使用するには、この原液を適切な両性電解質溶液(2%の両性電解質3~10、例:CAT.NO.10046)で1:100に希釈します。IEFゲルに使用するには、原液を直接ゲルに添加することができます。

Reference

M. Horka, Th. Willimann, M. Blum, P. Nording, Z.Friedl, K. Slais, Capillary isoelectric focusing with UV-induced fluorescence detection, J. of Chromatography A, 916, 65-71 (2001).

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Anion HPCE-Kit – CAT.NO. 29244

概要

キャピラリー電気泳動は、サンプルの微量分析のための効率的な分析分離技術であり、高速分離と高解像度を含む複数の利点があります。 pH 7.7バッファーシステムは、逆電気浸透流との間接UV検出による陰イオンの分析に最適です。 このバッファーは、フッ化物、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、チオ硫酸塩、燐酸塩の8つの一般的な陰イオンの分析に有効です。[1]

キットの構成

  • HPCE用バッファー溶液 pH7.7, 100 mL (CAT.NO. 82619)
    [Pyromellitic acid electrolyte buffer pH 7.7; composition: 2.25 mM pyromellitic acid, 6.50 mM sodium hydroxide, 0.75 mM hexamethonium hydroxide, 1.60 mM triethanolamine,
    pH: 7.7+/- 0.2 (250C); manufactured under clean room conditions; filtered through a 0.2 mm filter]
  • HPCE用 超純水, 100 mL (CAT.NO. 95283)
    [manufactured under clean room conditions; filtered through a 0.2 mm filter]
  • HPCE用 マルチエレメント 陰イオン標準溶液, 10 mL (CAT.NO. 29235; 100 ppm)
    [組成: 100 mg/L fluoride, 100 mg/L bromide, 100 mg/L chloride, 100 mg/L phosphate, 100 mg/L sulfate, 100 mg/L nitrate;
    manufactured from highly pure salts and water; filtered through a 0.2 mm filter]

    バッファー溶液pH 7.7を取り扱うとき、目または皮膚との接触を避け、安全眼鏡をかけてください。保管の際は密閉して下さい。
  • その他の必要な製品 (このキットには付属していません):
    HPCE 0.1 Mの水酸化ナトリウム溶液(CAT.NO.72079)もしくは同等品質の製品。

アプリケーション

  • このHPCE用バッファー溶液 pH7.7は、調製済みで希釈やその他の処理が不要です。
  • HPCE用 マルチエレメント 陰イオン標準溶液は、6つの陰イオンの100ppm(0.1 g/L)の原液として発売しています。マルチエレメント 陰イオン標準溶液を水で目的濃度(通常1ppm~10ppm)に希釈してHPCEで使用します。この標準溶液は、キャピラリー試験の同定や定量化に使用されます。
  • サンプル前処理:
    サンプルは、対象となる陰イオンを1~10mg/L程度の濃度に、HPCE用の超純水(CAT.NO.95283)で希釈するか、直接使用します。各対象の陰イオンにおける検出の限界は、およそ0.5mg/Lです。

作業手順

  • キャピラリー前処理:
    陰イオンの分離には、 内径50~75μm、全長50~60cm(入り口から検出器までは40~50cm)のフューズドシリカ(溶融石英)を使用します。HPCE用の水酸化ナトリウム溶液(CAT.NO.72079)で少なくとも10分、そしてpH7.7の溶剤で10~20分、キャピラリーを洗浄してください。このキャピラリーを他の溶剤、特にリン酸塩の溶剤(トラベルシューティング・ガイド(問題解決のマニュアル)をご参照ください)と一緒に使用しないでください。
  • サンプル注入:
    キャピラリー電気泳動では吸引注入法や電気的注入法が一般的に使用されます。陰イオンの分析については、一般的に吸引注入法が用いられます。この方法では、注入された試料濃度はサンプルバイアル中の物質と成分と同等です。しかしながら、電気的注入法では、高速移動性の陰イオンの予備濃縮が起こるため、注入される試料成分はサンプルバイアルの資料濃度に比べ、高速移動性の陰イオンの濃度が高くなります。
  • 電気泳動 条件:

    注入: 5 sec. at 0.5 PSI (corresponds to 30.2 mbar)
    分離電圧: - 30 kV ( [-] at the inlet side to [+] at the outlet side)
    検出: UV at 254 nm, inverted signal
    検出時間: 5 to 15 min
    予想電流: 15 – 20 mA
  • 単独での検出のキャピラリーの前処理:
    単独での検出の間は、HPCE用の7.7pHのバッファー溶剤で3分間洗浄します。
  • 使用後のキャピラリーや保管溶液:
    もし、キャピラリーを翌日も利用するのであれば、HPCE用の7.7pHのバッファーの中にキャピラリーを保管してください。キャピラリーを長期使用しない場合は、HPCE用の0.1M水酸化ナトリウム溶液(CAT.NO.72079)で5分間、そしてHPCE用の水(CAT.NO.95283)で2分間洗浄してください。更に2分間キャピラリーを乾かし、乾いた状態で保管してください。

ピーク同定

既知の陰イオンと泳動時間を比較して単独のピークを同定するのは最も良い方法です。最終的な同定において、スタンダードを陰イオンはサンプルに追加するべきです。追加された(スパイキング)スタンダードの量によりピーク シグナルを向上させなければなりません。

HPCE用 マルチエレメント 陰イオン標準溶液(CAT.NO.29235)に加え、弊社は、陰イオン検出の定量化や同定のための様々な陰イオン標準溶液やマルチエレメント 陰イオン標準溶液を提供します。

定量化

サンプル中の特定の陰イオンの定量化のために、目的の陰イオンのスタンダード溶液からキャリブレーションプロットを作成してください。

陰イオンスタンダード溶液の段階希釈を分析し、補正ピーク面積(ピーク面積/泳動時間)を計算してください。希釈されたスタンダード溶液(Figure 7)の濃度に対して、その面積をグラフにしてください。このキャリブレーションプロットから、サンプルの濃度は、キャリブレーション曲線と補正ピーク面積を比較することによって決定できます。

figure1_hpce_kit
ppm corr. area
0 0
2 97
5 454
10 832
20 1720

Figure 7. 硝酸塩(0 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm)のキャリブレーション・プロット:リファレンスアニオンとしてのチオ硫酸を除く

 

より精密な計測には、リファレンスアニオンの使用が効果的です。わずかに変化する注入量、バッファーまたは検出条件によって引き起こされるrun-to-runの偏差を取り除くために、これが行われます。分析するサンプル中に含まれていないリファレンスアニオンを選択してください。スタンダードアニオンのすべての段階希釈(例えば、1 ppm、5 ppm、10 ppm、20 ppmの硝酸)に選択されたリファレンスアニオン(例えば2 ppmチオ硫酸)を加えてください。サンプルにも同量のリファレンスアニオンを加えてください。

 

下記のように計算します。

 
Qstandard= relative peak area standard anion  Qsample= relative peak area sample anion
relative peak area reference anion relative peak area reference anion
 

希釈されたスタンダードアニオンの濃度に対して、Q standardをプロットしてください。このキャリブレーションプロットから、不明なサンプルの濃度は、キャリブレーション曲線とQ sampleの値を比較することによって測定しても良いです。run-to-runの変化が問題を引き起こすとき、このキャリブレーション曲線がよりよい相関係数(R2)を示すでしょう。

文献

[1] Rhemrev-Boom, M. M. (1994): Determination of anions with capillary electrophoresis and indirect ultra violet detection. J. Chromatography 680(2), 675–84.

トラブルシューティングガイド

 
Observation Matter Recommended Action
Migration times of the anions are not reproducible Capillary not fully reconstituted Rinse the capillary with 0.1 M NaOH and buffer, 20 min each. Perform 2 to 3 runs. Reproducible migration times usually are achieved after more than two runs.
Base line is dropping dramatically during run Capillary coated with components of other buffer systems Replace capillary and use the new capillary only for anion separations with the buffer solution pH 7.7 for HPCE
Very broad peaks, adjacent peaks are poorly resolved Sample concentration too high Dilute sample with water for HPCE
Current is dropping, no current observed Capillary is blocked Rinse with high pressure (with buffer or 0.1 M NaOH)
Cracked capillary Replace capillary
No peaks detected Polarity not reversed Use polarity from [-] to [+]

電気泳動図

Electropherogram:Separation of bromide (1), chloride (2), sulfate (3), nitrate (4), fluoride (5), and phosphate (6)

Figure 8 Separation of bromide (1), chloride (2), sulfate (3), nitrate (4), fluoride (5), and phosphate (6) each at a concentration of 6 mg/l (6 ppm).

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有機モディファイヤー

CAT.NO. Description Purity/Concentration Package Size
07673 18-Crown-6 (1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadecane) ≧99.5% (GC) 5g, 10g, 500mg
12059 N-Acryloylamido-ethoxyethanol 溶液 50% in H2O 1mL, 5mL
16013 Brij® 35 P 溶液 50% in H2O 100mL
28205 Heptakis(2,3-di-O-acetyl-6-O-sulfo)-beta-cyclodextrin heptasodium salt ≧95.0%  250mg
89451 Heptakis(3-O-acetyl-2,6-di-O-methyl)-beta-cyclodextrin   1g
89452 Heptakis-(2,3,6-tri-O-ethyl)-beta-cyclodextrin ≧95%  1g
90727 gamma-Cyclodextrin phosphate sodium salt, purum   100mg

両性電解質

CAT.NO. Description Purity/Concentration Package Size
10043 pH 3.0-10.0 40% in H2O 5mL, 25mL
11923 pH 3.0-6.0 40% in H2O 10mL, 25mL
10038 pH 4.0-6.0 40% in H2O 10mL, 25mL
10048 pH 5.0-7.0 40% in H2O 10mL, 25mL
10049 pH 5.0-8.0 40% in H2O 10mL
10051 pH 6.0-8.0 40% in H2O 10mL, 25mL
08689 pH 8.0-10.0 40% in H2O 10mL, 25mL

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