受託DNAシーケンス解析 よくいただく質問

• 解析はどのようにおこなわれますか？
• シグマで推奨しているキット以外で精製したPlasmidサンプル、PCR産物の解析は可能ですか？
• PCR産物（Crude）を選択しても注文画面で鋳型濃度を入力しないと次へ進めません。ヘルプの画面ではPCR産物（Crude）の必要濃度は特に記載されていないのですが、測定しないと注文できませんか？
• 準備されているユニバーサルプライマーの種類と配列は？
• シーケンス解析の注文をする時に、解析に使用するプライマーの注文を同時におこなうことはできますか？
• 再解析というのはどういうオプションですか？
• GCリッチというのはどういうオプションですか？
• Gatewayというのはどういうオプションですか？
• QD値とはどういう値ですか？
• 解析をおこなったサンプルはすぐに廃棄されますか？
• 解析が完了したサンプルを追加でシーケンス解析することは可能ですか？
• 多検体解析とは何解析からですか？
• PCR用もしくはシーケンス用のプライマーをデザインしてもらえますか？

 

Q1. 解析はどのようにおこなわれますか？

A1. 解析装置は　ABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer、シーケンス反応試薬は　BigDye Terminator v3.1　を用いて解析を行います。シーケンス反応済みサンプルの場合には、BigDye Terminator v3.1　または　v1.1　で反応を行ったサンプルのみお引き受け可能です。

 

Q2. シグマで推奨しているキット以外で精製したPlasmidサンプル、PCR産物の解析は可能ですか？

A2. 精製には弊社のGenEluteTM Plasmid Miniprep Kit、GenEluteTM PCR Clean-Up Kitをお奨めいたしますが、他社同等品での精製サンプルについても問題ございません。

 

Q3. PCR産物（Crude）を選択しても注文画面で鋳型濃度を入力しないと次へ進めません。ヘルプの画面ではPCR産物（Crude）の必要濃度は特に記載されていないのですが、測定しないと注文できませんか？

A3. PCR産物の一部をアガロースゲル等で電気泳動し、産物がシングルバンドであることを確認するとともにサイズマーカーのバンドの明るさとの比較から濃度を推定してください。注文画面での入力はあくまでもおおよそで結構です。

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Q4. 準備されているユニバーサルプライマーの種類と配列は？

A4. 下表のとおりです。これらは解析センターに用意されておりますので、ご用意していただく必要はありません。

プライマー	配列(5'-3')
M13F	GTAAAACGACGGCCAGT
M13R	GGAAACAGCTATGACCATG
T7	TAATACGACTCACTATAGG
T3	AATTAACCCTCACTAAAGGG
SP6	TATTTAGGTGACACTATAG
KS	TCGAGGTCGACGGTATC
SK	CGCTCTAGAACTAGTGGATC

 

Q5. シーケンス解析の注文をする時に、解析に使用するプライマーの注文を同時におこなうことはできますか？

A5. シーケンス解析の注文サイトからプライマーの注文をすることはできません。ご注文いただくプライマーを、解析センター（秋田県立大学バイオテクノロジーセンター）に直送して、解析をおこなうことが可能です。ご希望の場合はお問い合わせください。

 

Q6. 再解析というのはどういうオプションですか？

A6. 解析の結果、データの品質を表すQD値が「0」だった場合、同じサンプルについて条件を変更して解析をやり直すものです。ご注文画面のチェックボックスでONを選択いただいた場合は、自動的に再解析をおこないます。

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Q7. GCリッチというのはどういうオプションですか？

A7. 配列のGC含量が高い場合、鋳型やシーケンス反応産物が高次構造をとり、反応や解析が困難となるケースがございます。そのため、GCリッチなサンプルの場合は独自のプロトコルを使用いたします。おおよそですがGC％ 70％以上を目安としています。また、全体としてGC含量70%以下であっても配列中にGCが特に集中している、もしくは繰り返し配列が多いものなどは該当する場合がございます。該当する場合(もしくは該当すると予想される場合)はご注文画面のチェックボックスをONにして下さい。

 

Q8. Gatewayというのはどういうオプションですか？

A8. Invitrogen社のGateway®ベクターシステムをご使用の場合、 弊社のシーケンス反応のプロトコル変更が必要となります。Gateway®ベクターをご利用の方は、ご注文画面のチェックボックスをONにしてください。

 

Q9. QD値とはどういう値ですか？

A9. 本サービスでは、電気泳動によりクロマトグラムの個々のピークの中でベースコールができず、未同定となった塩基をカウントし、その割合によってQD「1」または「0」を評価いたします。

＜波形データの塩基数が600塩基以上の場合＞
101-600塩基の範囲でACGTのいずれにも判別できない未同定塩基（N）の数をカウントし、この数が50未満であればQD = 1、50以上であればQD = 0とします。

＜波形データの塩基数が600塩基未満の場合＞
101塩基-最終塩基の範囲について、Nの出現率が10％未満であれば、QD = 1、10％以上であればQD = 0とします。ただし波形が重複している場合、Nの数が多くなり、QD = 0となることがありますが、複数サンプルのコンタミネーションおよび、プライマーの結合部位が複数箇所存在していることなどが原因と予想される場合、QD = 1とさせていただきます。

QD算出例：波形データに表示される配列が450塩基であり、未同定塩基（N）数が30だった場合
30 / (450-100) × 100 = 8.6 %　 となるため、 QD = 1 となります。

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Q10. 解析をおこなったサンプルはすぐに廃棄されますか？

A10. 解析終了のご連絡の後、１週間以内に連絡をいただけない場合は破棄させていただきます。保管が必要な場合は弊社(genosysjp@sial.com)までご連絡ください。

 

Q11. 解析が完了したサンプルを使用して、追加でシーケンス解析することは可能ですか？

A11. 解析後のサンプルに余剰があれば対応可能です。ご希望の場合はお問い合わせください。

 

Q12. 多検体解析とは何解析からですか？

A12. 49解析以上からです。

 

Q13. PCR用もしくはシーケンス用のプライマーをデザインしてもらえますか？

A13. はい。有償となりますが可能です。詳しくはお問い合わせ(genosysjp@sial.com)ください。

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