Sigma-Aldrich 新発売 CRISPRゲノム編集システム SygRNA

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クローニングおよびin vitro転写が不要のCRISPR/Cas9ゲノム編集システムを試してみませんか
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CRISPR ゲノム編集システム SygRNAとは? シグマアルドリッチが提供するSygRNAは、crRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質からCRISPR/Cas9複合体を試験管内で調製して実施するゲノム編集法です。リボヌクレオタンパク質(RNP)そのものを使用することからRNP法とも呼ばれるこの手法は、人工的にデザインされた単一ガイドRNA(sgRNA、gRNA)ではなく、本来のCRISPR/Cas9を構成するRNAサブユニットcrRNA (crispr RNA)とtracrRNA(transactivating crispr RNA)を利用します。合成RNAによるゲノム編集が可能になったことで、CRISPR/Cas9複合体の品質向上と一実験あたりのコストセーブを同時に実現させました。サブクローニングが不要で、必要に応じてシグマアルドリッチが保有している全ゲノムCRISPRデータベース(ヒト、マウス、ラット)情報も無料でご利用いただけます。

シグマ アルドリッチのゲノム編集 SygRNAカスタム crRNAの3つの特長

1
クローニングやin vitro転写が不要
CRISPR/Cas9複合体を試験管内で調製するので、
プラスミドベクターの調製、PCRやin vitro転写等の操作が不要
2
安定したノックアウト
高品質の合成RNAおよび組換えタンパク質を使用することで、
安定したゲノム編集を行うことが可能
合成crRNAによるゲノム切断効率比較はこちら
3
経験を集約した安心のプレデザイン
ヒト、マウス、ラットゲノム上の18,000以上の遺伝子に対する
デザイン済切断標的配列情報をcrRNA配列として利用可能
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ノックアウト コスト目安

SygRNA(RNP法)とプラスミド法の比較

  CRISPR All-in-one
Plasmid
(gRNA,Cas9コンポーネントを
含むプラスミド)
CRISPR SygRNA
(crRNA, tracrRNA,
Cas9タンパク質)
自家調製プラスミド
細胞導入までの準備 Ready to Use 2-3時間
<準備内容>
RNP複合体調製
2-3日
<準備内容>
PCR
クローニング
シークエンス確認など
希望販売価格 ¥85,000 ¥50,000
(SygRNAスターターキット)
弊社取扱いなし
SygRNAは、自家調製プラスミドより、細胞導入までの工程が少なく、
CRISPR All-in-one Plasmidよりもコスト効率の高いゲノム編集を実現します

マルチウェルプレートにおけるSygRNA(RNP法)のコスト目安

  合成crRNA 2 nmol Cas9タンパク質
(CAS9PROT-250UG)
+
tracrRNA
crRNA(脱塩 2nmol)
+
Cas9タンパク質
(CAS9PROT-250UG)
+
tracrRNA
  使用可能プレート数 プレートあたりのコスト ウェルあたりのコスト
6ウェルプレート 1~11プレート ¥7,600~¥13,200 ¥1,000 ~ ¥3,650
24ウェルプレート 1~14プレート ¥6,000~¥10,500 ¥200~¥720
96ウェルプレート 1.5~19プレート ¥4,500~¥7,700 ¥40~¥150

crRNAを使用したノックアウト プロトコル

  • SygRNAの調製
  • SygRNA-Cas9複合体の調製
  • SygRNA-Cas9のトランスフェクション
  • ゲノムDNAの抽出とゲノム編集領域の増幅
  • ゲノム編集の確認

1. SygRNA (crRNA および tracrRNA) ストック溶液の調製

 crRNAとtracrRNAを10 mM Trisバッファー(pH 7~8)※1 でそれぞれ20 μM(20 pmol/μL)に調製してください。

 SygRNAストック溶液は1回の実験ごとの必要量に分注※2 し、複数の凍結融解を避けて-20℃(長期間の場合は-70℃)で保存してください。

試料 20μMのSygRNA
ストック溶液の調製に
必要なTrisバッファー容量
crRNAまたは
tracrRNA
2 nmol 100 μL
5 nmol 250 μL

※1 10 mM Trisバッファー(pH 7~8) 調製例:99 mLのヌクレアーゼフリー水(製品番号W4502)に1 mLの1 M Trizma塩酸塩(製品番号T2663)を混合します。

※2 SygRNAは使用直前に希釈し、等量混合してください。

2. Cas9タンパク質ストック溶液の調製

 凍結乾燥状態のCas9タンパク質を50%グリセロール溶液で5 mg/mL(30 pmol/μL)に調製してください。

 Cas9ストック溶液は1回の実験ごとの必要量に分注※3し、複数の凍結融解を避けて-20℃ (1ヶ月以上の長期保存の場合は-70℃)で保存してください。

試料 5 mg/mLのCas9ストック
溶液の調製に必要な
50%グリセロール溶液量
Cas9または
Cas9-D10A
Nickase
50 ug 10 μL
250 ug 50 μL
500 ug 100 μL

※3 as9タンパク質は、使用直前に製品付属の希釈バッファー(Dilution Buffer)で希釈してください。希釈後のCas9は氷上で6時間安定です。

3. 導入細胞の準備

トランスフェクション時に50~80%コンフルエントになるよう、実験前日に完全培地で細胞を継代してください。推奨培地量は6ウェルプレートで2.5 mLです。

4. SygRNA-Cas9複合体(crRNA:tracrRNA:Cas9 RNP)の調製(6ウェルプレートの1ウェル分)

※ SygRNA-Cas9複合体の調製はトランスフェクション直前に実施してください。

 等量(1.5 μL(30 pmol)~15 μL(300 pmol))のcrRNAストック溶液とtracrRNAストック溶液をチューブ内で混合し、氷上に静置します(SygRNA溶液)。

 1 μL~2 μLのCas9ストック溶液(30 pmol~60 pmol)をSygRNA溶液に添加し、穏やかにピペッティングして十分に混和します。

 氷上で30分静置し、 SygRNA-Cas9 RNPを形成させます。

 SygRNA-Cas9 RNP溶液に250 μLの無血清あるいは低血清培地を加えます。

5. 対象細胞へのSygRNA-Cas9複合体の導入(6ウェルプレート、TransIT®試薬使用時の例)

※ 使用する細胞とトランスフェクション方法の組み合わせにより、実験条件の最適化が必要になる場合があります。

 あらかじめ室温と平衡化したTransIT溶液5 μL~6.25 μLをSygRNA-Cas9 RNP溶液に添加(U2OS細胞の場合)し、穏やかにピペッティングして十分に混和します。

 室温で15分~30分インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させます。

 SygRNA-Cas9-TransIT溶液をウェルに均一に滴下します。

 ディッシュを前後左右に振とうし、十分均一になるよう撹拌後、細胞のインキュベーションを開始してください。トランスフェクション直後の培地交換は不要です。

6. ゲノム編集領域の確認及びクローニング

SygRNA-Cas9導入細胞からのゲノムDNA抽出
PCRによるターゲット領域増幅
Cel-1アッセイや制限酵素処理によるターゲット領域へのゲノム編集の確認
編集効率確認後のクローニングとシークエンシング

合成crRNAによるゲノム切断効率比較

合成crRNA、tracrRNAおよびCas9タンパク質から構成される
RNPの導入量に依存したゲノム切断効率比較

Nucleofection により、tracrRNA、AAVS1 crRNA(モル比 1:1 )と Cas9 タンパク質(1 µg あるいは 5 µg)を
K562 細胞に導入しました。CRISPR/Cas9 導入 48 時間後のゲノムに対する Cel-1 アッセイにより、
CRISPR/Cas9による切断後に生じた挿入、欠失および点突然変異を検出しました。
各レーンの下に記載されている数字は、Cel-1アッセイにより切断されたDNAフラグメントの割合です。

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大阪大学 微生物研究所 野田 大地助教、伊川 正人教授
CRISPR/Cas9システムを使った遺伝子改変マウス作製

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参考文献

Deltcheva E. et al. (2011) CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.
Nature, 471(7340), 602-607. (PMID: 21455174)

Jinek M. et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Science, 337(6096), 816-821. (PMID: 22745249)

Marraffini L. A. & Sontheimer E. J. (2010) Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity.
Nature, 463(7280), 568-571. (PMID: 20072129)

Cong L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.
(PMID: 23287718)

Chiang T. W. et al. (2016) CRISPR-Cas9(D10A) nickase-based genotypic and phenotypic screening to enhance genome editing. Sci. Rep., 6, 24356. (PMID: 27079678)

Mali P. et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121), 823-826.
(PMID: 23287722)

Wang H. et al. (2013) One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 153(4), 910-918. (PMID: 23643243)

Chen F. et al. (2017) Targeted activation of diverse CRISPR-Cas systems for mammalian genome editing via proximal CRISPR targeting. Nat. Commun., 8, 14958 (PMID: 28387220)

価格表

SygRNAを使用してノックダウンを実験を始められる際に、必要なコンポーネント(crRNA, tracrRNA, Cas9タンパク質)を、”スターターキット”としてご用意しました。

個別購入よりお得なセットですので、初めてお使いの方は、ぜひご活用ください

SygRNAカスタム crRNA スターターキット

セット内容 仕様またはカタログ番号 容量 単品で購入した場合 スターターキット価格
SygRNA - Synthetic crRNA HPLC精製フォーマット 2 nmol 13,500 53,500
50,000
SygRNA™ Synthetic tracrRNA TRACRRNA05N-5NMOL 5 nmol 10,000
espCas9 protein ESPCAS9PRO-50UG 50 μg 30,000

※在庫情報はリンク先のページをご覧ください。

  製品名 仕様またはカタログ番号 容量 希望販売価格(¥)
カスタムcrRNA合成 SygRNA - Synthetic crRNA 脱塩精製フォーマット 2 nmol 9,500
5 nmol 11,000
10 nmol 12,500
2 nmol x 5 13,000
HPLC精製フォーマット 2 nmol 13,500
5 nmol 15,000
10 nmol 16,500
2 nmol x 5 17,000
tracrRNA SygRNA™ Synthetic tracrRNA TRACRRNA05N-5NMOL 5 nmol 10,000
Cas9 protein spCas9 protein CAS9PROT-50UG 50 μg 20,000
CAS9PROT-250UG 250 μg 40,000
espCas9 protein ESPCAS9PRO-50UG 50 μg 30,000
ESPCAS9PRO-250UG 250 μg 60,000

オーダー方法

1 配列検索

プレデザインcrRNAをご希望の方は、
検索サイト https://crispr.sigmainformatics.com/CrisprSearch.phpにて検索。

検索方法についてはこちら >>
http://www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/functional-genomics-rnai/crisprs/search.html

2 オーダーフォームに記入

スターターキットを購入する場合は、SygRNAカスタム crRNA スターターキットにチェック。
単品購入をする場合は、SygRNA crRNA単品および関連製品購入にチェック。

カスタム合成crRNAをご希望の方は、ご希望の配列を、
プレデザインcrRNAをご希望の方はTargetIDをご記入ください。

3 発注完了

必要事項を入力し、「送信」ボタンをクリックして、発注完了となります。 弊社でご発注内容を確認した後、受注案内メールが送信されます。

4 出荷

受注案内メールが配信された後、
SygRNAカスタム crRNA スターターキットを購入された方は、15営業日以内に出荷いたします。
単品で購入された方は、在庫あり次第都度出荷いたします。