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shRNA

FAQ

shRNA関連製品について、お客様より頂くご質問をまとめてあります。ご参考になりましたら幸いです。

 

Index

 

価格、納期、ご注文方法

 

Question Answer
価格は? 価格についてはshRNA価格と納期をご参照ください。個別クローンでは、クローンセットが大変お得です。
注文方法は? 弊社遺伝子情報検索サイトでターゲット遺伝子を検索し、カタログ番号、Symbol, RefSeq ID、TRCN番号、製品形態を専用注文用紙(登録用紙)にご記入ください。注文登録用紙は弊社販売代理店様にお渡しいただき、代理店様が弊社天王洲宛にFAX:03-6756-8301 に送信されますと受注となります。(ご注文フロー) (PDF 670KB)
納期は? 大腸菌グリセロールストック:約2-3週間、精製プラスミドDNA:約3-4週間、レンチウイルスパーティクル:約4-6週間。更にオプションを追加した場合は追加したオプション項目毎に2週間づつ追加となります。
保存温度は? 大腸菌グリセロールストック:-70℃、精製プラスミドDNA:-20℃、レンチウイルスパーティクル:-70℃。 *凍結融解の繰り返しは避けてください。特にウイルスは-70℃で保存しても力価が次第に低下するため、お早めにご使用ください。
納品形態は? 1遺伝子あたり 2~20のshRNAクローン がデザインされており、遺伝子ごとに大腸菌グリセロールストック、プラスミドDNAまたはレンチウイルスパーティクルのいずれかを選択可能です。クローンごとにチューブに分かれております。
購入時に必要な提出書類は? 全てのshRNA製品は専用注文用紙(登録用紙)にてご利用者様情報が必要となります。これは、カルタヘナ法該当製品となるための法的処置です。専用注文用紙(登録用紙)はこちら。 (PDF 700KB)
製品を使用するにあたり、何かの法規の対象になりますか? 本製品は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律(通称カルタヘナ法)」の使用規制対象品となります。ご使用に際しては、規制に即し適切にお取り扱い下さい。詳細はカルタヘナ法規関連資料 (PDF 275KB) をご参照ください。  
必要とされる実験施設のセーフティレベルは? 施設管理者の方とご相談ください。

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バリデートと保証の範囲

 

Question Answer
ノックダウンの保証はしていますか? クローンセットでご購入いただいた場合、少なくとも1つのクローンがmRNAレベルで70%以上のノックダウンされることを保証しています。範囲についてはこちら をご覧ください。
ノックダウン検証済みのクローンはありますか? 約30%の80,000クローン、17,000遺伝子ターゲットについてバリデーションが完了しております。

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製品全般

 

Question Answer
siRNA(化学合成)と比較すると、Mission shRNA製品のメリットは何ですか? エンベロープタンパクを VSV-G に置換したレンチウイルスを利用することにより、幅広い細胞種に感染可能です。また、shRNA をゲノム配列に組み込むことにより、長期間の安定的なノックダウンが可能です。
利用できる遺伝子数は? ヒト 20,000遺伝子、マウス21,000 遺伝子以上のライブラリーをコレクションしています。TRC Ver.1 / 1.5とTRC Ver.2で約25万クローンをコレクションしています。各ターゲット遺伝子につき2~20クローンずつ利用可能です。詳細はこちら
shRNAのデザインは? 各クローンは、標的遺伝子のどこを切断するのですか? 弊社のshRNAの配列デザインは下記の通りです。
(Dicerで切断される領域)
[ヘアピンのループ構造]
(CCGG) -sense- [CTCGAG] -anti-sense-(TTTTTG)
「sense」の部分の配列が標的遺伝子の、どこに該当するかを検索していただければ切断箇所が分かります。
自分の目的とする遺伝子が見当たらない。 目的遺伝子のAcc.Noなどが変更されている可能性があります。最新情報についてはNCBI等のDBをチェックしてください。また、お客様のご指定の配列に対してTRCアルゴリズムによりshRNAをデザインすることも可能です。カスタムサービスの詳細はこちら
TRC とは何ですか? The RNAi Consortium の略で、ハーバードメディカルスクール(HMS)、マサチューセッツ工科大学(MIT)やノバルティス、イーライ・リリー、シグマアルドリッチなどの企業をふくめ、世界的な研究機関で構成されております。詳細はこちら
TRC1、TRC1.5、TRC2とはなんですか? TRC1はpLKO.1-puroベクター骨格を有したライブラリーです。TRC1.5はTRC1と同じベクター骨格を使用していますが、弊社オリジナルのライブラリーで、他社では販売しておりません。TRC2はpLKO.1-puroベクターにWPRE(the Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element)を追加した新しいベクター骨格を有したライブラリーです。詳細はこちら
なぜMission shRNAレンチウイルスは様々な細胞に感染できるのですか? 野生型のHIVは、ウイルスのエンベロープタンパクgp120が宿主細胞膜表面のCD4+ケモカインレセプターに結合するため、CD4陽性+ケモカインレセプター陽性の細胞のみ感染できます。それに対して、組換えHIVであるMission shRNAレンチウイルスはエンベロープタンパクを VSV-G に置換することで、広域の宿主細胞に感性性を持っています。 また、非分裂細胞にも利用できます。
製品の使用にあたり、何らかのライセンスが必要ですか? 特別なライセンス等は必要ありません。また、知的所有権についても研究目的では問題がございません。他研究室への譲渡等は出来ません。詳細はMISSIONラベルライセンスをご参照ください。
それぞれのクローンを自分で複製してもかまいませんか? 弊社製品の大腸菌グリセロールストック、精製プラスミドDNAを購入した後、研究開発の用途で複製されるのであれば、問題ありません。再販目的、他研究室への譲渡、治療・診断等の目的においては出来ません。
文献に引用する時はどのように記述すればいいでしょう? TRC1で、ヒト遺伝子の場合は『MISSION TRC-Hs1.0』、マウス遺伝子の場合は『MISSION TRC-Mm1.0』と明記して下さい。この記述で、『MISSION shRNAのTRC Ver.1.0』という意味になります。TRC1.5の場合は末尾を『1.5』、TRC2の場合は『2.0』としてください。 また、ご利用になりましたクローン番号『TRC0XXXXXXXX』を明記してください。
MISSION shRNAプラスミドのベクターマップ、配列などはありますか? あります。TRC1(/1.5)とTRC2の違い、各コントロールベクター、パッケージングプラスミド、カスタム用MISSION shRNAベクターコレクションなど詳細情報がございます。
ラット用のshRNAの設計・販売をして頂けますか? ラット用のshRNAにつきましては、カスタム注文をお受けしております。詳細はカスタムサービスをご参照ください。
アデノウイルスを使用したshRNA製品はありますか? MISSION shRNAはレンチウイルスのみのご提供となります。

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コントロール

 

Question Answer
ネガティブコントロールに適した製品はありますか? MISSION shRNA導入のネガティブコントロール用として、non-target shRNAがお勧めです。non-target shRNAはヒト、マウス遺伝子と 4bp 以上のミスマッチがあるため、ヒトおよびマウスのどの遺伝子発現もノックダウンしません。プラスミドは(TRC1:製品番号SHC002、TRC2:製品番号SHC202)、レンチウイルス粒子は(TRC1:製品番号SHC002V、TRC2:製品番号SHC202V)を販売しております。コントロールの詳細はこちら
ポジティブコントロール、ノックダウン効率の確認に適した製品はありますか? MISSION shRNAのノックダウン効率確認のポジティブコントロール用として、既に発現しているTurboGFPをノックダウンする製品がございます。TurboGFPノックダウン用shRNAプラスミド(TRC1:製品番号SHC004、TRC2:製品番号SHC204)、TurboGFPノックダウン用shRNAレンチウイルス粒子(TRC1:製品番号SHC004V、TRC2:製品番号SHC204V)を販売しております。これらのshRNAが導入された細胞は、既に発現している緑色の蛍光が消失します。コントロールの詳細はこちら
ポジティブコントロール、shRNAの導入効率の確認に適した製品はありますか? MISSION shRNA導入のコントロール用としてTurboGFP発現用プラスミドは(TRC1:製品番号SHC003、TRC2:製品番号SHC203)、TurboGFP発現用レンチウイルス粒子は(TRC1:製品番号SHC003V、TRC2:製品番号SHC203V)を販売しております。これらのshRNAが導入された細胞は緑色の蛍光を発します。コントロールの詳細はこちら
蛍光タンパク質発現用のコントロールが多数ありますが、どのように選択したらよいですか? 目的に応じた蛍光をご選択ください。各蛍光波長、製品との対応表、詳細はこちらです

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スクリーニングライブラリー

 

Question Answer
スクリーニング用(多数の遺伝子を確認する)の製品はありますか? 様々なタイプのライブラリーをご用意しております。詳細はこちら
遺伝子ファミリー(セット)の販売はないですか? 現在、ヒト21種類、マウス3種類の遺伝子ファミリーセットがご利用可能です。ご興味のある遺伝子ファミリーが無い場合は任意のクローンを選択したカスタムライブラリーの製造も可能です。遺伝子ファミリーセットはこちら。カスタムライブラリーについてはこちらをご覧ください。※遺伝子ファミリーセットの遺伝子リストは開示しておりません。

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プロトコール、技術情報

 

Question Answer
各shRNA製品のプロトコールは? 基本的なプロトコールについてはまずは、こちらをご覧ください
pLKO.1ベクターの安定性、レンチウイルスの安定性などのデータは? 基礎データの詳細はMISSION Application Dataをご参照ください。
1細胞内で異なる2つの遺伝子をノックダウンできますか? 薬剤耐性遺伝子を、それぞれ異なる種類のものにした2つのベクターを用い、2回セレクションを行うことで、異なる2遺伝子のノックダウンが可能です。この場合、ベクターの変更のカスタムクローニングサービスをご利用ください。
shRNA 発現プロモーターは何ですか? human U6 promoter (pol III promoter)を導入しております。
pLKO.1-puroはWPRE配列を保持していますか? TRC 1, TRC 1.5 にはWPRE配列は含まれておりません。TRC 2には、shRNA発現を安定化するためにWPRE配列を含んでおります。
細胞ごとに、細胞死を起こすレンチウイルスの濃度が異なります。なぜですか? 細胞種によりウイルスへの耐性が異なるためです。細胞種ごとに毒性がないウイルス濃度を、細胞生存曲線を作成して見極める必要があります。
実験を始める前に、感染効率 (感染多重度, Multiplicity of Infection, MOI)を調べたいのですが、どうやるのですか?またMOIとは何ですか? MOIは、1細胞あたりに導入されるレンチウイルスパーティクルの数を示しています。新しい細胞系にレンチウイルスを導入する場合は、使用する各細胞系で効率的な導入に必要なレンチウイルスの最適な量を知る必要があります。幾つかのMOIで実際にテストする事が強く推奨されます。異なるMOI値で細胞の生存曲線を作成してご確認下さい。詳細はこちら。 (PDF 180KB)
レンチウイルスパーティクルのtiter は? 通常製品は約 1×10^6 TU/ml を 200 µl 納品いたします。過去の平均タイターは1×10^7 TU/ml以上です。 カスタムオプションとして、タイター(1x10^7、10^8、10^9 TU/ml)と容量(0.1ml、1ml、2ml、5ml、10ml)をお選びいただけます。
高タイター作製プロトコールはこちらをご参照ください。
titer 測定法は? p24 assay の原理は? レンチウイルスのエンベロープタンパクである、p24 の測定を行っております。p24 titer assay(ELISA法)を用いております。詳細はこちら。 (PDF 180KB)
200µl のウイルス(約1×10^6のTU/ml)で何回分の実験に利用できますか? 必要なウイルスは使用する細胞により異なるため、正確な回数はご回答できかねます。たとえば HeLa や HEK293T の場合、約50回分の実験が可能です。(96-well plate、~16,000 cells) primary cell など、遺伝子導入が困難な細胞はさらに多くの量が必要となります。詳細はこちら。 (PDF 180KB)
ウイルスパーティクル作製、パッケージングを行うにはどうすれば良いですか? 弊社のレンチウイルスパッケージングミックスプラスミドDNAをご利用ください。製品番号SHP001です。
MISSIONウイルス粒子を増殖させて再度使用することはできますか? MISSIONウイルス粒子は自己増殖に必要なアクセサリー遺伝子を除去しているために増殖いたしませ。そのため、レンチウイルス粒子を再増殖して使用することはできません。
MISSIONのレンチウイルスベクターと、レトロウイルスのパッケージングプラスミドを使ってウイルス粒子を作成することは可能ですか? レトロウイルス用のパッケージングプラスミドでは、作成できません。ウイルス作製に必要な遺伝子が同じ名前でも、レンチウイルスとレトロウイルスでは配列が異なります。
細胞からmRNAを抽出する時にレンチウイルスは失活しますか? レンチウイルス粒子はあまり安定ではないため、基本的にRNAを抽出する工程でレンチウイルス粒子は不活性化されます。フェノールを含む試薬はレンチウイルス粒子を不活性化します。それ以外の方法でも、cell lysateを調整するようなRNA抽出方法であれば、やはりレンチウイルス粒子は不活性化されます。
1度解凍させたレンチウイルスの保存方法は? shRNAレンチウイルスパーティクルは、一度解凍した後に再凍結して保存する事は可能です。ただし、凍結融解の繰り返しはウイルス粒子の活性を著しく低下させるため、1度解凍した後は分注保存が適当です。解凍は室温で容器を水につけて行い、直ちに氷上に移します。4℃などではウイルス粒子は徐々に活性が低下し、24時間程度しか活性が維持されない可能性があります。可能な限り早く再凍結する必要があります。また、ウイルス粒子は遮光状態でお取り扱いください。
ウイルス濃度を高める方法は? 特にウイルス濃度を高める必要がある場合は、下記の論文を参考にしてください。Geraerts, M., et al, Upscaling of lentivirus vector production by tangential flow filtration. J. Gene Med., 7, 1299-1310 (2005).
カスタムクローニングは? CMV、ネオマイシン耐性、turboGFPなど導入済みのベクターや、IPTGによる発現誘導などのオプションをご用意しております。これ以外にもお客様ご要望の配列をレンチウイルス粒子にしてお返しするなどのカスタムサービスも行っております。
shRNA ベクターをトランスフェクションするプロトコールは? 細胞種によります。通常使用しているプロトコールで問題ありません。
プラスミドストックはエンドトキシンを排除してますか? エンドトキシンについては、測定しておりません。
大腸菌からプラスミドDNAが高収量で得られません。 ウイルスベクターは抽出および精製が困難であることが知られています。 抽出にはエンドトキシン除去が可能なGenElute Endotoxin-Free Midiprep Kit(製品番号PLED35)、またはGenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit(製品番号NA0400S、NA0400、NA0410)等をお勧めします。 さらに、一般的な方法としてMission shRNAプラスミドの収率を挙げるための対処法として以下の方法がございます。
大腸菌株GC5、GC10、HB101、DH10、DH5 を使用する。
抗生物質として Carbenicillin(例:Sigma 製品番号C3416)を使用する。Maxiprep を行う。大腸菌の密度を最大にする

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