| Question |
Answer |
| 各shRNA製品のプロトコールは？ |
基本的なプロトコールについてはまずは、こちらをご覧ください。 |
| pLKO.1ベクターの安定性、生成レンチウイルスの安定性などのデータは? |
上記FAQ項目以外にも多数の基本データを公開しております。詳細はMISSION Application Dataをご参照ください。 |
| 1細胞内で異なる2つの遺伝子をノックダウンできますか？ |
セレクション用の薬剤耐性遺伝子を、それぞれ異なる種類のものにした２つのベクターを用いて、2回セレクションを行うと異なる２遺伝子のノックダウンが可能です。（オプションとして薬剤耐性遺伝子の異なるベクターへの変更サービス (175KB PDF) はあります。） |
| shRNA 発現プロモーターは何ですか？ |
human U6 promoter (a pol III promoter)を導入しております。 |
| pLKO.1-puroはWPRE配列を保持していますか？ |
TRC 1, TRC 1.5 にはWPRE配列は含まれておりません。TRC 2には、shRNA発現を安定化するためにWPRE配列を含んでおります。詳細はこちら。 |
| 遺伝子の大きさは？ |
遺伝子の大きさについてですが、それぞれのクローンにweb上でご覧になれる配列が組みこまれています。（また、基本ベクターのshRNA部分を除いた長さは、pLKO.1-puro：7052bp、TRC2-pLKO-puro：7484bp です。）詳細はこちら。 |
| ウイルスシステムによるノックダウンの原理について教えてください。 |
レンチウイルスは専用のパッケージングベクター(製品番号SHP001)、細胞によって作成することができます。（弊社では細胞の販売はしておりません）。shRNA 配列を保持したレンチウイルスは、細胞内のクロモゾームに取り込まれ、shRNA を発現します。また、レンチウイルスは VSV-G envelope をもつので、様々な細胞に感染することができ、非分裂細胞にも利用できます。原理の詳細はこちらのRNAiプロセス概要 (274KB PDF) をご参照ください。 |
| 細胞ごとに、細胞死を起こすレンチウイルスの濃度が異なります。なぜですか？ |
細胞種によりウイルスへの耐性が異なるためです。細胞種ごとに毒性がないウイルス濃度を細胞生存曲線を作成して見極める必要があります。 |
| クローンで実験を始める前に、感染効率 (感染多重度, Multiplicity of Infection, MOI)を調べたいのですが、どうやるのですか？またMOIとは何ですか？ |
MOIは、１細胞あたりに導入されるレンチウイルスパーティクルの数を示しています。新しい細胞系にレンチウイルスを導入する場合は、使用する各細胞系で効率的な導入に必要なレンチウイルスの最適な量を知る必要があります。幾つかのMOIで実際にテストする事が強く推奨されます。異なるMOI値で細胞の生存曲線を作成してご確認下さい。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| レンチウイルスパーティクルのtiter は？ |
通常製品は約 1×10＾6 TU/ml で 200 µl 納品いたします。過去の平均タイターは1×10＾7 TU/ml以上です。 カスタムオプションとして、タイター（1x10^7、10＾8、10＾9 TU/ml）と容量（0.1ml、1ml、2ml、5ml、10ml）をお選びいただけます。
高タイター生成のプロトコルはこちらをご参照ください。 |
| titer 測定法は？ p24 assay の原理は？ |
レンチウイルスのエンベロープタンパクである、p24 の測定を行っております。p24 titer assay（ELISA法）を用いております。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| 200µl のウイルス（約1×10＾6のTU/ml）で何回分の実験に利用できますか？ |
必要なウイルスは使用する細胞により異なるため、正確な回数はご回答できかねます。たとえば HeLa や HEK293T の場合1回の実験に 4μl 必要であるため、約50回分の実験が可能です。（96-well plate、～16,000 cells） primary cell など、遺伝子導入が困難な細胞はさらに多くの量が必要となります。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| ウイルスパーティクル作成、パッケージングにはどのプラスミドを使えばいいですか？ |
弊社のレンチウイルスパッケージングミックスプラスミドDNAをご利用ください。製品番号SHP001です。 |
| MISSIONウイルス粒子は増やして再度使用することはできますか？ |
MISSIONウイルス粒子は増殖に必要な遺伝子を十分に持たないため、増殖しません。そのため、レンチウイルス粒子を増やして使用することはできません。
同様にISSIONレンチウイルス粒子とパッケージングキット（製品番号SHP001）をHEK293T細胞に共トランスフェクションしてもMISSIONウイルス粒子は増殖しません。レンチウイルス粒子から作製されるshRNAには、ウイルス外殻に取り込まれるためのパッケージングシグナルがないため、HEK293T細胞内で新たに合成されたウイルス外殻に取り込まれません。そのため、レンチウイルスとパッケージングキットからレンチウイルス粒子を新しく作製することはできません。 |
| MISSIONのレンチウイルスベクターと、レトロウイルスのパッケージングプラスミドを使ってウイルス粒子を作成することは可能ですか？ |
レトロウイルス用のパッケージングプラスミドでは、作成できません。ウイルス作製に必要な遺伝子が同じ名前でも、レンチウイルスとレトロウイルスでは配列が異なります。 |
| 細胞からmRNAを抽出する時にレンチウイルスは失活しますか？ |
レンチウイルス粒子はあまり安定ではないため、基本的にRNAを抽出する工程でレンチウイルス粒子は不活性化されます。フェノールを含む試薬はレンチウイルス粒子を不活性化します。それ以外の方法でも、cell lysateを調整するようなRNA抽出方法であれば、やはりレンチウイルス粒子を不活性化します。 |
| レンチウイルスパーティクルは1度解凍させると保存がきかないのでしょうか？ |
shRNAレンチウイルスパーティクルは、一度解凍した後に再凍結して保存する事は可能です。ただし、凍結融解の繰り返しはウイルス粒子の活性を著しく低下させるため、1度解凍した後は1回使用分量に小分けして凍結保存が適当です。
解凍は室温で容器を水につけて行い。直ぐに氷上に置きます。4℃などではウイルス粒子は徐々に活性が低下し、24時間程度しか活性が維持されない可能性があります。可能な限り早く再凍結する必要があります。また、ウイルス粒子は遮光状態でお取り扱いください。 |
| ウイルス濃度を高める方法は？ |
特にウイルス濃度を高める必要がある場合は、下記の論文を参考にしてください。
Geraerts, M., et al, Upscaling of lentivirus vector production by tangential flow filtration. J. Gene Med., 7, 1299-1310 (2005). |
| カスタムクローニングは？ |
CMV、ネオマイシン耐性、tGFPなどの発現導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております。これ以外にもお客様ご要望の配列をレンチウィルス粒子にしてお返しするなどのカスタムサービスを受け付けております。詳細はこちら。 |
| shRNA ベクターをトランスフェクションするプロトコルは？ |
細胞種によります。通常使用しているプロトコル (215KB PDF) で問題ありません。 もし現在トランスフェクションにトラブルがある場合、シグマアルドリッチで販売している ESCORT ＩＩ トランスフェクション試薬（製品番号L6037）をお勧めします。 |
| プラスミドストックはエンドトキシンは排除してますか？ |
エンドトキシンについては、調べておりません。 |
| 大腸菌からプラスミドDNAが高収量で得られません。 |
ウイルスベクターは抽出および精製が難しいのが知られています。 私たちは（エンドトキシン除去用の）GenElute Endotoxin-Free Midiprep Kit（製品番号PLED35）、または
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit
（製品番号NA0400S、NA0400、NA0410）等による精製をお勧めします。 さらに、一般的な方法としてMission shRNAプラスミドの収率を挙げるための対処法として以下の方法がございます。
- 大腸菌株GC5、GC10、HB101、DH10、DH5 を使用する。
- 抗生物質として Carbenicillin（例：Sigma 製品番号C3416）を使用する。
- Maxiprep を行う。
- 大腸菌の密度を最大にする
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