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shRNA
FAQ | ||
shRNA関連製品について、お客様より頂くご質問をまとめてあります。ご参考になりましたら幸いです。
Index
価格、納期、ご注文方法
| Question | Answer |
|---|---|
| 価格は? | 価格についてはshRNA価格と納期をご参照ください。個別クローンでは、クローンセットが大変お得です。 注文方法は、オンライン検索で |
| 注文方法は？ | YFG検索でターゲット遺伝子を調べて、型番、遺伝子symbol、TRCN番号、製品形態を専用注文用紙（登録用紙）にご記入ください。注文登録用紙は弊社販売代理店様にお渡しください。代理店様が弊社天王洲宛にFAX：03-5796-7415 にお送りいただきますと受注致します。 |
| 納期は? | 大腸菌グリセロールストック：約2-3週間、精製プラスミドDNA：約3-4週間、レンチウイルスパーティクル：約4-6週間。更にオプションを追加した場合は追加したオプション項目毎に2週間づつ追加となります。 |
| 保存温度は？ | 大腸菌グリセロールストック：-70℃、精製プラスミドDNA：-20℃、レンチウイルスパーティクル：-70℃。 ＊凍結融解の繰り返しは避けてください。特にウイルスは-70℃で保存しても力価が次第に低下するため、お早めにご使用ください。詳細の製品仕様はこちら (175KB PDF)。 |
| 納品形態は？ | １遺伝子あたり 2～20クローンのshRNA がデザインされており、各遺伝子ごとにE-coli グリセロールストック、プラスミドDNAまたはレンチウイルスパーティクルのいずれかを選択可能です。クローンごとにチューブに分かれております。 |
| 購入時に必要な提出書類はありますか? | 全てのshRNA製品は専用注文用紙（登録用紙）にてご利用者様情報が必要となります。これは、カルタヘナ法該当製品となるための法的処置です。ご購入いただいた遺伝子情報などが他のお客様に開示される事は一切ございません。専用注文用紙（登録用紙）はこちら。 |
| 製品を使用するに当り、何かの法規の対象になりますか？ | 本製品は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（通称カルタヘナ法）」の使用規制対象品となります。ご使用に際しては、規制に即し適切にお取り扱い下さい。詳細はカルタヘナ法規関連資料 (275KB PDF) をご参照ください。 |
| 実験施設の必要レベルは？ | 施設管理者の方とご相談ください。 |
| カルタヘナ法対応のために必要な書類はどこにありますか?また、製品の使用に当り、特別な申請が必要ですか？ | MISSION shRNA関連製品のカルタヘナ法規関連資料はこちら (275KB PDF) です。各研究機関の申請に従って下さい。大臣申請は必要ございません。 |
| TRCメンバーには製薬メーカーもあるが、もし注文したら自分がどの製品を注文したという情報がもれてしまうのでしょうか？ | 米国本社に注文するときはユーザー情報を連絡しないので問題ありません。ユーザー登録をお願いしているのはカルタヘナ法などで組換え生物・第二種生物等を扱う際に譲渡先等を把握しておく必要があるためです。 |
バリデートと保証の範囲
| Question | Answer |
|---|---|
| ノックダウンの保証はしてますか？ | TRC によって開発されたデザインアルゴリズムに基づいて、5つのクローンのうち少なくとも1つは、転写の70%以上のノックダウンを与えると予測されます。保証の範囲についてはこちら (218KB PDF) をご覧ください。 |
| ノックダウン検証済みのクローンはありますか？ | 現在、ライブラリー全体のバリデーションを行っております。現在までに約10%の38,000クローン、11,000遺伝子ターゲットについてバリデーションが完了しております。優先的にTRC Ver.2のクローンよりバリデートを進めております。 |
製品全般
| Question | Answer |
|---|---|
| siRNA（化学合成）と比較すると、Mission shRNA製品のメリットは何ですか？ | shRNA をインサートに持つベクターを用いているので、セレクションすることで細胞内での長期的なノックダウンが可能です。また、エンベロープタンパクを VSV-G に置き換えたレンチウイルスを利用することにより、幅広い細胞種に感染可能です。詳細はこちら (246KB PDF)。 |
| 利用できる遺伝子は？ | ヒト 18,000遺伝子、マウス16,000 遺伝子以上のライブラリーをコレクションしています。TRC Ver.1 / 1.5とTRC Vre.2で更に15万クローン（2011年夏完成予定）をコレクションしています。各ターゲット遺伝子につき2～20クローンづつ利用可能です。詳細はこちら。 |
| shRNAのデザインは? 各クローンは、標的遺伝子のどこを切断するのですか？ | 弊社のshRNAの配列デザインは下記の通りです。
「sense」の部分の配列が標的遺伝子の、どこに該当するかを検索していただければ切断箇所が分かります。 |
| ターゲット遺伝子のクローンリストはありますか？ | 遺伝子リストのファイルはご用意しておりません。 YFGで検索してください。Gene No.、Gene Symbol、生物種、配列情報などで検索可能です。 |
| 自分の目的とする遺伝子が見当たらない。 | 現在まだ全てのクローンはできておりません。 ライブラリーが完成するまで、四半期ベースで新しい遺伝子を販売して参りますので、 ターゲット遺伝子がない場合も今後リリースする可能性があります。 また遺伝子のアクセション番号か遺伝子シンボルが変わっている可能性もあります。最新情報についてはNCBIをチェックしてください。また、お客様のご指定の配列に対してTRCアルゴリズムによりshRNAをデザインすることも可能です。カスタムサービスの詳細はこちら。 |
| TRC とは何ですか？ | The RNAi Consortium の略で、ハーバードメディカルスクール（HMS)、マサチューセッツ工科大学（MIT)やノバルティス、イーライ・リリー、シグマアルドリッチなどの企業をふくめ、世界的な研究機関で構成されております。詳細はこちら (174KB PDF)。 |
| TRC1、TRC1.5、TRC2とはなんですか? | TRC1はpLKO.1-puroベクターで構成されたshRNA製品です。TRC1.5はTRC1と同じベクターで構成されておりますが、弊社オリジナルの製品で、他社では販売しておりません。TRC2はpLKO.1-puroベクターにWPRE(the Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element)を追加した新しいバージョンのクローン群です。詳細はこちら。 |
| なぜMission shRNAレンチウイルスは様々な細胞に感染できるのですか？ | 野生型のHIVは、ウイルスのエンベロープタンパクgp120が宿主細胞膜表面のCD4+ケモカインレセプターに結合するため、CD4陽性+ケモカインレセプター陽性の細胞のみ感染できます。それに対して、組換えHIVであるMission shRNAレンチウイルスはエンベロープタンパクを VSV-G に置き換えることで、広域の宿主細胞に感受性を持っています。 また、非分裂細胞にも利用できます。詳細は、ウイルスタイプの比較、MISSIONレンチウイルスの生成について (246KB PDF)。 |
| 製品の使用にあたり、何らかのライセンスが必要ですか？ | 特別なライセンス等は必要ありません。また、知的所有権についても研究目的では問題がございません。多研究室への譲渡等は出来ません。詳細はMISSIONラベルライセンスをご参照ください。 |
| それぞれのクローンを自分で複製してもかまいませんか？ | 弊社製品の大腸菌グリセロールストック、精製プラスミドDNAを購入した後、研究開発の用途で複製されるのであれば、問題ありません。再販目的、多研究室への譲渡、治療・診断等の目的においては出来ません。 |
| 文献に引用する時はどのように記述すればいいでしょう？ | TRC1で、ヒト遺伝子の場合は『MISSION TRC-Hs1.0』、マウス遺伝子の場合は『MISSION TRC-Mm1.0』と明記して下さい。この記述で、『MISSION shRNAのTRC Ver.1.0』という意味になります。TRC1.5の場合は末尾を『1.5』、TRC2の場合は『2.0』としてください。 また、ご利用になりましたクローン番号『TRC0XXXXXXXX』を明記してください。 |
| MISSION shRNAプラスミドのベクターマップ、配列などはありますか? | あります。TRC1(/1.5)とTRC2の違い、各コントロールベクター、パッケージングプラスミド、カスタム用MISSION shRNAベクターコレクションなど詳細情報がございます。まずはMISSION shRNAベクターコレクション選択ガイド (855KB PDF) をご参照ください。 |
| 大腸菌グリセロールストック製品の大腸菌株は? | DH5α-T1R (DH5α) |
| ラット用のsiRNAの設計・販売をして頂けますか？ | ラット用のshRNAにつきましては、カスタム注文をお受けしております。詳細はカスタムサービスをご参照ください。 |
| アデノウイルスを使用したshRNA製品はありますか? | MISSION shRNAのウイルス種類はレンチウイルスのみです。レンチウイルスはアデノウイルスより感染細胞の種類が多いという特徴があります。さらに、アデノウイルスでは一過性な抑制ですが、レンチウイルスは持続的な抑制が可能です。ウイルスタイプの比較、MISSIONレンチウイルスの生成について (246KB PDF) 。 |
| ベクターにpgk puro を使用したshRNAはありますか？ | 弊社では販売しておりません。 |
コントロール
| Question | Answer |
|---|---|
| ネガティブコントロールに適した製品はありますか？ | MISSION shRNA導入のネガティブコントロール用として、non-target shRNAがお勧めです。non-target shRNAはヒト、マウス遺伝子と 4bp 以上のミスマッチがあるため、ヒトおよびマウスのどの遺伝子発現もノックダウンしません。プラスミドは（TRC1：製品番号SHC002、TRC2：製品番号SHC202）、レンチウイルス粒子は（TRC1：製品番号SHC002V、TRC2：製品番号SHC202V）を販売しております。 |
| ポジティブコントロール、ノックダウン効率の確認に適した製品はありますか？ | MISSION shRNAのノックダウン効率確認のポジティブコントロール用として、既に発現しているTurboGFPをノックダウンする製品がございます。TurboGFPノックダウン用shRNAプラスミド（TRC1：製品番号SHC004、TRC2：製品番号SHC204）、TurboGFPノックダウン用shRNAレンチウイルス粒子（TRC1：製品番号SHC004V、TRC2：製品番号SHC204V）を販売しております。これらのshRNAが導入された細胞は、既に発現している緑色の蛍光が消失します。その他のノックダウン効率確認用のポジティブコントロールについては、こちらをご参照ください。 |
| ポジティブコントロール、shRNAの導入効率の確認に適した製品はありますか？ | MISSION shRNA導入のコントロール用としてTurboGFP発現用プラスミドは（TRC1：製品番号SHC003、TRC2：製品番号SHC203）、TurboGFP発現用レンチウイルス粒子は（TRC1：製品番号SHC003V、TRC2：製品番号SHC203V）を販売しております。これらのshRNAが導入された細胞は緑色の蛍光を発します。 |
| 蛍光タンパク質発現用のコントロールがありますが、同選択したらよいですか？ | 目的に応じた蛍光をご選択ください。各蛍光波長、製品との対応表、詳細はこちらです。 |
スクリーニングライブラリー
| Question | Answer |
|---|---|
| スクリーニング用（多数の遺伝子を確認する）の製品はありますか？ | 様々なタイプのライブラリーをご用意しております。詳細はこちら。 |
| 遺伝子ファミリー（セット）の販売はないですか？ | 現在、ヒト21種類、マウス3種類のファミリーセットがご利用可能です。ご興味のある遺伝子ファミリーが無い場合、もしくはお客様のお好きなクローンを選択したカスタムライブラリーの製造も可能です。遺伝子ファミリーセットはこちら。カスタムライブラリーについてはこちらをご覧ください。 ※遺伝子ファミリーセットの遺伝子リストは開示しておりません。 |
プロトコール、技術情報
| Question | Answer |
|---|---|
| 各shRNA製品のプロトコールは？ | 基本的なプロトコールについてはまずは、こちらをご覧ください。 |
| pLKO.1ベクターの安定性、生成レンチウイルスの安定性などのデータは? | 上記FAQ項目以外にも多数の基本データを公開しております。詳細はMISSION Application Dataをご参照ください。 |
| 1細胞内で異なる2つの遺伝子をノックダウンできますか？ | セレクション用の薬剤耐性遺伝子を、それぞれ異なる種類のものにした２つのベクターを用いて、2回セレクションを行うと異なる２遺伝子のノックダウンが可能です。（オプションとして薬剤耐性遺伝子の異なるベクターへの変更サービス (175KB PDF) はあります。） |
| shRNA 発現プロモーターは何ですか？ | human U6 promoter (a pol III promoter)を導入しております。 |
| pLKO.1-puroはWPRE配列を保持していますか？ | TRC 1, TRC 1.5 にはWPRE配列は含まれておりません。TRC 2には、shRNA発現を安定化するためにWPRE配列を含んでおります。詳細はこちら。 |
| 遺伝子の大きさは？ | 遺伝子の大きさについてですが、それぞれのクローンにweb上でご覧になれる配列が組みこまれています。（また、基本ベクターのshRNA部分を除いた長さは、pLKO.1-puro：7052bp、TRC2-pLKO-puro：7484bp です。）詳細はこちら。 |
| ウイルスシステムによるノックダウンの原理について教えてください。 | レンチウイルスは専用のパッケージングベクター(製品番号SHP001)、細胞によって作成することができます。（弊社では細胞の販売はしておりません）。shRNA 配列を保持したレンチウイルスは、細胞内のクロモゾームに取り込まれ、shRNA を発現します。また、レンチウイルスは VSV-G envelope をもつので、様々な細胞に感染することができ、非分裂細胞にも利用できます。原理の詳細はこちらのRNAiプロセス概要 (274KB PDF) をご参照ください。 |
| 細胞ごとに、細胞死を起こすレンチウイルスの濃度が異なります。なぜですか？ | 細胞種によりウイルスへの耐性が異なるためです。細胞種ごとに毒性がないウイルス濃度を細胞生存曲線を作成して見極める必要があります。 |
| クローンで実験を始める前に、感染効率 (感染多重度, Multiplicity of Infection, MOI)を調べたいのですが、どうやるのですか？またMOIとは何ですか？ | MOIは、１細胞あたりに導入されるレンチウイルスパーティクルの数を示しています。新しい細胞系にレンチウイルスを導入する場合は、使用する各細胞系で効率的な導入に必要なレンチウイルスの最適な量を知る必要があります。幾つかのMOIで実際にテストする事が強く推奨されます。異なるMOI値で細胞の生存曲線を作成してご確認下さい。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| レンチウイルスパーティクルのtiter は？ | 通常製品は約 1×10＾6 TU/ml で 200 µl 納品いたします。過去の平均タイターは1×10＾7 TU/ml以上です。 カスタムオプションとして、タイター（1x10^7、10＾8、10＾9 TU/ml）と容量（0.1ml、1ml、2ml、5ml、10ml）をお選びいただけます。 高タイター生成のプロトコルはこちらをご参照ください。 |
| titer 測定法は？ p24 assay の原理は？ | レンチウイルスのエンベロープタンパクである、p24 の測定を行っております。p24 titer assay（ELISA法）を用いております。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| 200µl のウイルス（約1×10＾6のTU/ml）で何回分の実験に利用できますか？ | 必要なウイルスは使用する細胞により異なるため、正確な回数はご回答できかねます。たとえば HeLa や HEK293T の場合1回の実験に 4μl 必要であるため、約50回分の実験が可能です。（96-well plate、～16,000 cells） primary cell など、遺伝子導入が困難な細胞はさらに多くの量が必要となります。詳細はこちら (180KB PDF)。 |
| ウイルスパーティクル作成、パッケージングにはどのプラスミドを使えばいいですか？ | 弊社のレンチウイルスパッケージングミックスプラスミドDNAをご利用ください。製品番号SHP001です。 |
| MISSIONウイルス粒子は増やして再度使用することはできますか？ | MISSIONウイルス粒子は増殖に必要な遺伝子を十分に持たないため、増殖しません。そのため、レンチウイルス粒子を増やして使用することはできません。 同様にISSIONレンチウイルス粒子とパッケージングキット（製品番号SHP001）をHEK293T細胞に共トランスフェクションしてもMISSIONウイルス粒子は増殖しません。レンチウイルス粒子から作製されるshRNAには、ウイルス外殻に取り込まれるためのパッケージングシグナルがないため、HEK293T細胞内で新たに合成されたウイルス外殻に取り込まれません。そのため、レンチウイルスとパッケージングキットからレンチウイルス粒子を新しく作製することはできません。 |
| MISSIONのレンチウイルスベクターと、レトロウイルスのパッケージングプラスミドを使ってウイルス粒子を作成することは可能ですか？ | レトロウイルス用のパッケージングプラスミドでは、作成できません。ウイルス作製に必要な遺伝子が同じ名前でも、レンチウイルスとレトロウイルスでは配列が異なります。 |
| 細胞からmRNAを抽出する時にレンチウイルスは失活しますか？ | レンチウイルス粒子はあまり安定ではないため、基本的にRNAを抽出する工程でレンチウイルス粒子は不活性化されます。フェノールを含む試薬はレンチウイルス粒子を不活性化します。それ以外の方法でも、cell lysateを調整するようなRNA抽出方法であれば、やはりレンチウイルス粒子を不活性化します。 |
| レンチウイルスパーティクルは1度解凍させると保存がきかないのでしょうか？ | shRNAレンチウイルスパーティクルは、一度解凍した後に再凍結して保存する事は可能です。ただし、凍結融解の繰り返しはウイルス粒子の活性を著しく低下させるため、1度解凍した後は1回使用分量に小分けして凍結保存が適当です。 解凍は室温で容器を水につけて行い。直ぐに氷上に置きます。4℃などではウイルス粒子は徐々に活性が低下し、24時間程度しか活性が維持されない可能性があります。可能な限り早く再凍結する必要があります。また、ウイルス粒子は遮光状態でお取り扱いください。 |
| ウイルス濃度を高める方法は？ | 特にウイルス濃度を高める必要がある場合は、下記の論文を参考にしてください。 Geraerts, M., et al, Upscaling of lentivirus vector production by tangential flow filtration. J. Gene Med., 7, 1299-1310 (2005). |
| カスタムクローニングは？ | CMV、ネオマイシン耐性、tGFPなどの発現導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております。これ以外にもお客様ご要望の配列をレンチウィルス粒子にしてお返しするなどのカスタムサービスを受け付けております。詳細はこちら。 |
| shRNA ベクターをトランスフェクションするプロトコルは？ | 細胞種によります。通常使用しているプロトコル (215KB PDF) で問題ありません。 |
| プラスミドストックはエンドトキシンは排除してますか？ | エンドトキシンについては、調べておりません。 |
| 大腸菌からプラスミドDNAが高収量で得られません。 | ウイルスベクターは抽出および精製が難しいのが知られています。 私たちは（エンドトキシン除去用の）GenElute Endotoxin-Free Midiprep Kit（製品番号PLED35）、または
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit
（製品番号NA0400S、NA0400、NA0410）等による精製をお勧めします。 さらに、一般的な方法としてMission shRNAプラスミドの収率を挙げるための対処法として以下の方法がございます。
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