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＝ゲノムサイエンスの常識を変えよう＝
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Dihydrofolate reductase（DHFR）の不活化 ZFNを用いて遺伝子を欠損させ、新たに遺伝的に異なるDHFR-/-細胞株を作成した。 左図はZFNにより誘導されたDHFR-/-クローンの遺伝子型。それぞれの配列対は作成された細胞株中におけるDHFR遺伝子の2つのアレルを示している。それぞれの変異アレルにおいて、挿入された塩基は赤で、欠損した塩基はドットで示されている。 DHFRの2つのアレル同時破壊はセレクションを行うことなく１％の頻度で観察された。論文はこちら |
例２：ZFNによる遺伝子ノックイン
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異なる3つのプロモーター・転写ユニットを持つ配列を在来のIL２Rγ遺伝子座に導入する 右図はサザンブロットによる標的組み込み頻度の測定。ドナー相同領域左側隣接領域に位置するIL２Rγフラグメントを用いて、ZFN処理されたゲノムDNA（左）と単一細胞由来クローンから抽出されてゲノム（右）を検出した。 本実験により少なくとも7.8ｋｂまでのインサートを標的に組み込めることが示された。マーカーによるセレクションがない状態で挿入頻度は５％以上であった。 論文はこちら |
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ZFN － その原理とシステム概要
Zinc Finger Nucleases（ZFN）は、a) Zinc-Fingerと呼ばれるDNA結合ドメインと、b) FokIのDNA切断ドメイン、２つの機能ドメインで構成された人工キメラタンパク質です。 DNAを切断するためにFokIはヘテロダイマーを形成しなければならないため、ZFNは機能的な対として導入する必要があります。
DNA結合ドメインであるZinc-Finger部分がゲノム上の特異的な遺伝子配列を認識し、DNA切断ドメインであるFokI部分が切断することにより非常に特異性の高い“ハサミ”となり、結果Double Strand Break (DSB)を引き起こします。
これによってゲノム配列の編集を容易に行う事が出来、標的遺伝子の欠損、挿入、改変（置換）が生じた細胞・生物を得ることができます。
システム概要
興味のある遺伝子に対する一対のZFNがトランスフェクションによって細胞株へ導入された時、核内でZFNを介したゲノムのエディティングが起こります。
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A ： 細胞内に導入されたZFNはDNA切断ドメインであるFokI部分がヘテロダイマーを形成できるように、Zinc-FingerドメインがDNAのそれぞれの標的配列を認識します。 |
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B ： ZFN対はDNAのDouble Strand Break を引き起こします |
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C-i ： ZFN対のみトランスフェクションした場合は細胞の修復機構であるNHEJ（Non-Homologous End Joining)プロセスによってゲノムの修復を誘導しますが、このNHEJで修復された場合、比較的高頻度に修復エラーが起こり、結果、塩基対の欠損、挿入が生じます。 C-ii ： ZFN対と鋳型配列を同時にトランスフェクションした場合は、やはり細胞の修復機構であるHDR（Homology Dependent Repair）プロセスによって、標的部位へ鋳型配列が挿入されます。※GOI＝Gene Of Interest |
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D-i ： C-iで起きた塩基対の欠損、挿入は結果的にフレームシフトを起こし、最終的に遺伝子がノックアウトされます。 D-ii ： C-iiで起きた標的部位への鋳型配列の挿入により結果的に遺伝子がノックインされます。 |
構成品と簡易プロトコール（実験の流れ）
カスタム製品には以下のものが含まれています（Ready-made品、ノックインキットなどは内容が異なります。詳細は各製品ページをご覧ください）
- mRNA：10回分(導入した細胞内でZinc finger nucleaseを合成するmRNA)
- Vector：mRNA作製用。提供したmRNAがなくなった場合に、このVectorを細胞内に導入してmRNAを作る事が可能です。
- プライマー：ミスマッチassay用のポジコン。遺伝子配列確認用。標的遺伝子を中簡にはさむプライマーで、発現が停止した細胞を特定するために使用できます。
- プロトコール
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簡易プロトコール（実験の流れ） １）デザインされたZFNをトランスフェクションによって細胞に導入する 弊社でデザインされたZFNはmRNAの形でお届けします。これをお好みの方法トランスフェクションします。DNA切断ドメイン部分であるFokI のヘテロダイマー構造が結果24塩基を認識し、非常に特異性の高い「ハサミ」となって、double strand break(DSB)をDNAの標的遺伝子の位置で起こします。（A～B） 「ハサミ」であるZFNペアが標的遺伝子部分でDSBを引き起こしDNAを切断した後、DNAの自然な修復プロセスであるNon-Homologous End Joining (NHEJ)が起こりますが、しかしこの修復は不完全であり、結果として切断部位に塩基の欠損または追加（一般的には数十塩基対）が生じます。（D～E) |
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２）PCRでZFNの切断効率を確認する 短く（もしくは長く）なってしまったゲノムDNAのZNF切断部位を製品添付のPCRプライマーを用いて増幅します。結果として得られるPCR産物（野生型と変異を持つアンプリコンの混合物です）を熱変性し、再アニールします。野生型と変異アリルのPCR産物が再アニールした場合ミスマッチが生じます。（F～H） 再アニール断片をミスマッチ特異的ヌクレアーゼで処理します。反応物はミスマッチ部分が切断されたことを示す分子量の小さい切断片を検出するためにゲル電気泳動します。 小さい断片は変異アリルの頻度を反映しており、in vitro ZFN効率の尺度となります。（I） ３）クローニング ４）クローンの希釈、各クローンのスクリーニング |
お客様の用途に合わせてデザインさせていただくカスタムサービス、ノックアウト・ノックイン用のキットなど、幅広くラインアップしています。
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CompoZr カスタム ZFN サービス お客様の御興味のある遺伝子に対し、特異的に結合するZinc Fingerモチーフを自由に設計いたします。 あらゆる細胞・生物種でノックアウト・ノックイン・組み換えが自由自在！ まずは御相談下さい！ 御相談は：テクニカルサポート（TEL 03-5796-7330 FAX 03-5796-7335 email : sialjpts@sial.com）まで！ |
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CompoZr Knockout ZFN, Ready-to-made kit 各遺伝子に対してプレデザインされたノックアウト用のキットです。各遺伝子を確実にノックアウトしたバリデーション済みの製品をお届けします。
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CompoZr Targeted Integration Kit アデノ随伴ウイルスが特異的に組み込まれる領域（AAVS1)を利用したキットです。
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御注文から納品までの流れ（カスタムオーダーの場合）
| お客様 | 興味のある遺伝子・生物種・アプリケーション（Knock in /Knock out）をご選択ください （フォームにご記入いただきます） |
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| シグマ | お客様に御記入いただいたフォームにそってお見積もりを作成、お客様にお返しします |
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| お客様 | 弊社代理店様を通じて御注文いただきます |
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| シグマ | お客様の御希望の標的遺伝子にあわせ、どこのRNAを認識して切断するかの設計に入ります 設計が終了した段階で大体15－20セットのデザインをお客様にご提示します |
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| お客様 | お客様が一番御使用になりたいデザインをお選びいただきます |
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| シグマ | 具体的に作成に入ります |
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| 10週間程度 | Varidation：作成したZFNを実際に細胞で（ヒト（K562）、マウス（Neuro-2A)、ラット（C6)、ハムスター（CHO K1)で機能するか確認します ※複数出来た場合には一番良かったものをお客様にお届けします Shipment：製品はmRNAとPlasmidの形でお届けします |
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| 1-2週間程度 お客様 |
納品 |
基本的に御注文から納品までは4ヶ月程度ですが、バリデーションの時点で再度作り直しになった場合、作成に難しい遺伝子などをお選びになった場合などは納期が延びる場合もございます。
CompoZr Knockout ZFN, Ready-to-made kitの納期は一ヶ月程度、CompoZr Targeted Integration Kitは1週間～10日程度です（通関の関係上、納期が延びる場合もございますので、何とぞ御了承下さい）。
ZFN使用に関するライセンスはこちらをご覧下さい
ZFNに関するFAQ
皆様に良く頂戴する御質問を集めてみました。FAQはこちらから
CompoZr ZFNテクノロジーを利用した論文集
細胞へのノックイン・ノックアウトだけでなく、ZFNを利用したノックアウトラット作成の論文などを掲載しています。こちらからどうぞ！