遺伝子機能解析

CompoZr® Zinc Finger Nuclease

 

CompoZr Zinc Finger Nuclease(ZFN) テクノロジーの利点

あらゆる細胞・生物種で自由にゲノム改変が可能!!

  • 短期間でのノックアウトラット/マウス 作成が可能
  • 効率的な遺伝子変異動物の作製..ES細胞が要りません!
  • 簡単な操作でノックイン・ノックアウト細胞株 構築可能
  • 疾患モデル動物の作製に!
  • ヒトの疾患関連遺伝子研究に!ゲノ厶創薬に!
  • siRNAでは出来ない完全なノックアウトが可能です

対象アプリケーション

  • Functional Genomics/Target Validation
  • RNAiでは不可能な完全な遺伝子ノックアウト
  • Cell-based Screening
  • 在来遺伝子にプロモーター、フュージョンタグやレポーターを組み込んだノックイン細胞株の作製
  • Cell Line Optimization
  • タンパク質や抗体の高収量細胞株を作製

CompoZr Zinc Finger Nuclease (ZFN)は配列特異的にDNAを切断することの出来る人工キメラタンパク質です。この技術を利用することで数々の細胞のゲノムを自在に改変することが可能となり、有用物質産生のための細胞化工や遺伝子治療、再生医療などの研究等、様々な分野への応用が期待されます。

 

ノックイン・ノックアウト例

例1:ZFNによる遺伝子ノックアウト
ZFNにより誘導されたDHFR-/-クローンの遺伝子型

Dihydrofolate reductase(DHFR)の不活化

ZFNを用いて遺伝子を欠損させ、新たに遺伝的に異なるDHFR-/-細胞株を作成した。

左図はZFNにより誘導されたDHFR-/-クローンの遺伝子型。それぞれの配列対は作成された細胞株中におけるDHFR遺伝子の2つのアレルを示している。それぞれの変異アレルにおいて、挿入された塩基は赤で、欠損した塩基はドットで示されている。

DHFRの2つのアレル同時破壊はセレクションを行うことなく1%の頻度で観察された。論文はこちら

 
例2:ZFNによる遺伝子ノックイン

異なる3つのプロモーター・転写ユニットを持つ配列を在来のIL2Rγ遺伝子座に導入する

右図はサザンブロットによる標的組み込み頻度の測定。ドナー相同領域左側隣接領域に位置するIL2Rγフラグメントを用いて、ZFN処理されたゲノムDNA(左)と単一細胞由来クローンから抽出されてゲノム(右)を検出した。

本実験により少なくとも7.8kbまでのインサートを標的に組み込めることが示された。マーカーによるセレクションがない状態で挿入頻度は5%以上であった。

論文はこちら

サザンブロットによる標的組み込み頻度の測定

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ZFN - その原理とゲノム改変の機序

Zinc Finger Nucleases(ZFN)

Zinc Finger Nucleases(ZFN)は、a) Zinc-Fingerと呼ばれるDNA結合ドメインと、b) FokIのDNA切断ドメイン、2つの機能ドメインで構成された人工キメラタンパク質です。 DNAを切断するためにFokIはヘテロダイマーを形成しなければならないため、ZFNは機能的な対として導入する必要があります。

DNA結合ドメインであるZinc-Finger部分がゲノム上の特異的な遺伝子配列を認識し、DNA切断ドメインであるFokI部分が切断することにより非常に特異性の高い“ハサミ”となり、結果Double Strand Break (DSB)を引き起こします。

これによってゲノム配列の編集を容易に行う事が出来、標的遺伝子の欠損、挿入、改変(置換)が生じた細胞・生物を得ることができます。

ZFNによるゲノム改変機構

興味のある遺伝子に対する一対のZFNがトランスフェクションによって細胞株へ導入された時、核内でZFNを介したゲノムのエディティングが起こります。

A : 細胞内に導入されたZFNはDNA切断ドメインであるFokI部分がヘテロダイマーを形成できるように、Zinc-FingerドメインがDNAのそれぞれの標的配列を認識します。

B : ZFN対はDNAのDouble Strand Break を引き起こします

C-i : ZFN対のみトランスフェクションした場合は細胞の修復機構であるNHEJ(Non-Homologous End Joining)プロセスによってゲノムの修復を誘導しますが、このNHEJで修復された場合、比較的高頻度に修復エラーが起こり、結果、塩基対の欠損、挿入が生じます。

C-ii : ZFN対と鋳型配列を同時にトランスフェクションした場合は、やはり細胞の修復機構であるHDR(Homology Dependent Repair)プロセスによって、標的部位へ鋳型配列が挿入されます。※GOI=Gene Of Interest

D-i : C-iで起きた塩基対の欠損、挿入は結果的にフレームシフトを起こし、最終的に遺伝子がノックアウトされます。

D-ii : C-iiで起きた標的部位への鋳型配列の挿入により結果的に遺伝子がノックインされます。

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ZFN製品のご紹介

CompoZr カスタム ZFN サービス

お客様の御興味のある遺伝子に対し、特異的に結合するZinc Fingerモチーフを自由に設計いたします。

あらゆる細胞・生物種でノックアウト・ノックイン・組み換えが自由自在!

製品名 基本価格(※※)
 CompoZr カスタムZFN サービス(plasmid plus mRNA)   ¥1,030,000
 CompoZr カスタムZFN サービス(plasmid only)  ¥900,000

※※ 本サービスはカスタムサービスのため上記の価格は参考価格です
詳細はコチラ(英文)
カスタムZFNお申し込みはコチラ

CompoZr Knockout ZFN, Ready-to-made kit

ヒト・マウス・ラット遺伝子のノックアウトがお手軽に!
遺伝子ノックアウト用にSIGMAでデザインした検証済みZFNのキットです。
カスタムサービスに比べ、お手頃価格でノックアウト実験が可能になります。

CAT.NO.
製品名 価格
 CKOZFN○○○○ -1kt 
(○は数字4-5桁)
 CompoZrノックアウトZFN kit( plasmid plus mRNA)   ¥628,000 
 CKOZFND○○○○ -1kt 
(○は数字4-5桁)
 CompoZrノックアウトZFN Kit, plasmid only  ¥498,000
製品詳細はコチラ(英文
製品番号検索・専用発注書はコチラ

CompoZr Targeted Integration Kit

サイレンシングを受けにくく発現が安定しており、且つ外来配列の挿入による悪影響が認められないことが報告されている、AAVS1(ヒト用)およびRosa26(マウス・ラット用)を標的としています。 検証済みZFNとドナープラスミドがセットになったキットです。 挿入部位・コピー数による影響を受けることなく、簡便に再現性良く安定発現細胞株を作出することが可能になります。

CAT.NO.
製品名 価格
 CTIM - 1KT   マウス用 CompoZr Targeted Integration Kit - mRosa26 
 ¥350,000 
 CTI1 - 1KT
 ヒト用 CompoZr Targeted Integration Kit - AAVS1  ¥350,000
 CTIR - 1KT
 ラット用 CompoZr Targeted Integration Kit - rRosa26  ¥350,000
製品詳細はコチラ(英文)

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CompoZr カスタムZFNサービスのお申込み

お客様 Custom ZFN申込書(117KB PDF)に英語にて必要事項をご記入後、sialjpts@sial.comにメールにてお送りください。
追記型pdf形式になっておりますので、記入欄に直接タイプしていただけます。
1-6の項目は必須、7-9については使用目的により、いずれかにご記入ください。
また、11以降はオプション項目(別料金)となっております。詳細はお問い合わせください。
 
シグマ お客様に御記入いただいたフォームにそってお見積もりを作成、お客様にお返しします
 
お客様 弊社代理店様を通じて御注文いただきます
 
シグマ お客様の御希望の標的遺伝子にあわせ、どこのRNAを認識して切断するかの設計に入ります
設計が終了した段階で大体15-20セットのデザインをお客様にご提示します
 
お客様 お客様が一番御使用になりたいデザインをお選びいただきます
 
シグマ 具体的に作成に入ります
 
10週間程度 Varidation:作成したZFNを実際に細胞で(ヒト(K562)、マウス(Neuro-2A)、ラット(C6)、ハムスター(CHO K1)で機能するか確認します
※複数出来た場合には一番良かったものをお客様にお届けします
 
1-2週間程度
お客様
納品

基本的に御注文から納品までは4ヶ月程度ですが、バリデーションの時点で再度作り直しになった場合、作成に難しい遺伝子などをお選びになった場合などは納期が延びる場合もございます。

CompoZr Knockout ZFN, Ready-to-made kitの納期は一ヶ月程度、CompoZr Targeted Integration Kitは1週間~10日程度です(通関の関係上、納期が延びる場合もございますので、何とぞ御了承下さい)。

ZFN使用に関するライセンスはこちらをご覧下さい

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CompoZr ノックアウトZFNキットの検索はコチラ(266KB PDF)

専用発注書はコチラ(459KB PDF)  必要事項をご記入の上、代理店様にお渡しください。

                                                                           (記入欄に直接タイプしていただけます)

 

 

ZFNに関するFAQ

皆様に良く頂戴する御質問を集めてみました。FAQはこちらから

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CompoZr ZFNテクノロジーを利用した論文集

細胞へのノックイン・ノックアウトだけでなく、ZFNを利用したノックアウトラット作成の論文などを掲載しています。こちらからどうぞ!

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