LC-MSによるイソプレノイド経路代謝物の解析

By: Rudolf Köhling, Roland Meier, Bernhard Schönenberger and Roland Wohlgemuth
Sigma-Aldrich®, Buchs, Switzerland
, Biofiles, Vol. 8, No. 17


 

イソプレノイドリン酸やピロリン酸などのイソプレノイド経路の代謝物は、ステロール、ドリコール、ユビキノン、プレニル化天然物質/タンパク質の生成に至るまでの中心的な生物学的中間体です。そのような経路を分子レベルで詳細に調べるためには、その分析的特性評価と定量化の新たな手法を開発することが鍵となります。そのため、幅広いイソプレノイド(ピロ)リン酸を並行して評価できる、新しく高性能の分離法について強い関心が寄せられています。

 

1単位のイソプレノイド(ピロ)リン酸

このようなリン酸化化合物の分離は、ほとんどが立体選択性とイオン相互作用によって左右されます。このため、シクロデキストリンカラムをHILICモードで操作し、水系移動相のpHとイオン強度により制御するという、比較的まれな方法を選択する必要が生じます。

シクロデキストリンベースのAstec Cyclobond 2000固定相の性能は、当初の試験法1をはるかに凌ぎ、IP/DMAPとIPP/DMAPPそれぞれのベースラインでの分離を可能にした初めての製品です。公表されているもう1つの方法2は、異なるイソプレノイド単位数をもつピロリン酸を識別できることが明らかになっていますが、IPP/DMAPPやGP/NPなど異性体イソプレノイド(ピロ)リン酸は識別できません。

pH 4~8の溶離液が試験されましたが、pH 7未満の場合にのみ分離が成功しました。流速も、もう1つの重要なパラメータであることが判明しました。0.5mL/分が最適値でしたが、1mL/分の時はベースラインでの分離ができませんでした。

 

複数単位のイソプレノイド(ピロ)リン酸

未知の代謝物を分離するための一般的な方法は、反対の極性をもつ2種類の固定相(C18とHILICなど)を用いることです。LC/MS検出モードには、緩衝液及び溶媒がESIなどのMSイオン源と適合しているため、HILICが非常に適していますが、高度な極性をもつ分析物のHILICによる分離は、緩衝液と固定相の特性により強く影響されます。

極性の高いイソプレノイド(ピロ)リン酸の場合、HILICを行ってもクロマトグラフィーの結果が不良となるため、これは適用できません。しかし、MS適合試薬とFused Core®RPカラムを使ったイオンペアクロマトグラフィー3,4は、その強力な代替法であることが明らかになりました。酢酸ジヘキシルアミン はIPC試薬として機能し、イソプレノイドリン酸の分離と検出にいくつかのプラスの作用をもっています。

  1. ESI(-)モードでは視認できません
  2. [M-H]イオンの検出力が向上します
  3. Ascentis Express C8/C18カラムの効率が向上します(図3

本研究は2013年Metabolomic Society Conference(スコットランド、グラスゴウ開催)でポスター発表されました。

 

図1

図2 シクロデキストリンベースの固定相Astec Cyclobond I 2000を用いた、IP/DMAP及びIPP/DMAPP異性体のHILIC分離。

図3 イソプレノイドリン酸及びピロリン酸の同族系統の分離。流速と勾配を調整することで、同じ設定で最長の同族体[ゲラニルゲラニル(ピロ)リン酸、GGP/GGPP]のクロマトグラフィーが可能です。

 

Materials

Product # Image Description Molecular Formula
581412-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 5 cm × 1.0 mm  
581435-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 10 cm × 1.0 mm  
581436-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 15 cm × 1.0 mm  
581413-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm  
581414-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 3 cm × 2.1 mm  
581401-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 10 cm × 2.1 mm  
581400-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 5 cm × 2.1 mm  
581402-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 15 cm × 2.1 mm  
581415-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 2 cm × 3.0 mm  
581403-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 3 cm × 3.0 mm  
581404-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 5 cm × 3.0 mm  
581416-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 2 cm × 4.6 mm  
581417-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 3 cm × 4.6 mm  
581406-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 5 cm × 4.6 mm  
581407-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 10 cm × 4.6 mm  
581408-U   Ascentis® C8 HPLCカラム 3 μm particle size, L × I.D. 15 cm × 4.6 mm  
21010AST   Astec® Cyclobond® I 2000 Chiral HPLC Guard Column Column, 5 μm particle size, L × I.D. 2 cm × 1.0 mm  
21100AST   Astec® Cyclobond® I 2000 Chiral HPLC Guard Column Cartridge, 5 μm particle size, L × I.D. 2 cm × 4.0 mm  
20018AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 10 cm × 2.1 mm  
20019AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 15 cm × 2.1 mm  
20020AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 25 cm × 2.1 mm  
20021AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 5 cm × 4.6 mm  
20022AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 10 cm × 4.6 mm  
20023AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 15 cm × 4.6 mm  
20024AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 25 cm × 4.6 mm  
20034AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 5 μm particle size, L × I.D. 25 cm × 10.0 mm  
22024AST   Astec® CYCLOBOND® I 2000 Chiral HPLCカラム 10 μm particle size, L × I.D. 25 cm × 4.6 mm  
54747 γ,γ-Dimethylallyl phosphate ammonium salt ≥93.0% (TLC) C5H11O4P · xNH3
56901 Geranyl monophosphate lithium salt ≥95.0% (TLC) C10H19O4P · xLi+
18577 Neryl monophosphate lithium salt ≥95.0% (TLC) C10H19O4P · xLi+
12436 Neryl pyrophosphate lithium salt ≥95.0% (TLC) C10H20O7P2 · xLi+
69579 γ,γ-ジメチルアリルピロリン酸 アンモニウム塩 ≥93.0% (TLC) C5H12O7P2 · xNH3
18629 イソペンテニルリン酸 二リチウム塩 ≥95.0% (TLC) C5H9Li2O4P
76532 ゲラニルピロリン酸 リチウム塩 ≥95.0% (TLC) C10H20O7P2 · xLi+
44270 trans,trans-ファルネシル ピロフォスファート アンモニウム塩 ≥95.0% (HPLC) C15H28O7P2 · xNH3

 

References

  1. M. Lange, et al. Isoprenoid Biosynthesis. Metabolite Profiling of Peppermint Olil Gland Secretory Cells and Application to Herbicide Target Analysis. Plant Physiol. 127, 305-14 (2001).
  2. J.M. Buescher, et al. Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for Fast and Robust Quantification of Anoinic and Aromatic Metabolites. Anal.Chem. 82, 4403-12 (2010).
  3. L.R. Snyder, et al. Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd ed., Wiley (2010).
  4. M. Holcapek, et al. High performance liquid chromatography-mass spectrometric ananlysis of sulfonated dyes and internediates. J.Chromatogr. A 926(1), 175-86 (2001).

 

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