分子生物学

電気泳動

核酸の電気泳動

DNAやRNAの分子量を調べるために、アガロースゲルやアクリルアミドゲルを用いて電気泳動が行われます。核酸はリン酸基を持つため負の電荷を帯び、陽極に引き寄せられます。また、アガロースは海藻から得られるポリサッカリドで、一般的に0.5から2.0%の濃度でDNAやRNAの電気泳動のゲルとして利用されます。アガロースゲルは核酸の移動に適した孔径の格子状構造をしていて、電気泳動によって核酸はサイズに応じて陰極に移動します。

 

 

アガロースゲルの作成方法例

  1. 必要な量のアガロースを秤量します。
  2. ビーカーまたはフラスコに必要量の1xTAEバッファーを入れ、秤量したアガロースを加えます。

    【例】1%アガロースゲルを200 mL作成する場合:200 mLの1xTAEバッファーをフラスコに入れ、2 gのアガロースを加えて軽く混和

  3. アガロースゲルに臭化エチジウム(EtBr)を入れる場合は、最終濃度が0.5 μg/mLになるようにEtBrを添加します。

    【例】200 mLのゲル溶液に10 mg/mLのEtBr溶液(E1510)を10 μL添加

  4. 三角フラスコの口を耐熱性のあるラップで覆い、ラップには数箇所穴を開けます。
  5. 電子レンジで数分間温め、フラスコをゆすって撹拌します(溶液が泡立たないよう、フラスコを机の上にそって回転させるように揺すります)。

    注意)フラスコおよび溶液は非常に熱いので取り扱いには注意して下さい。

  6. もう一度電子レンジで 1~2分間温め、フラスコをゆすって撹拌します。

    補足)溶液が透明になるまで繰り返します。

  7. 自然に冷まし、50~55℃になったらゲル作成用のトレーに静かに流し入れ、コームを挿します。

    補足)ゲル溶液の表面に気泡が生じた場合は、マイクロチップやキムワイプの先端で吸い取ります。

  8. ゲルが固まるまで室温で静置します(通常30分間から1時間程度)。
  9. 固まったゲルはすぐに使用するか、保存する場合は溶媒(この場合はTAEバッファー)と同じ溶液中に一時的に保存します。
主な製品 グレード 製品情報 製品番号
アガロース 分子生物学用グレード。低EEO 低EEOのため高い分離能。DNase、RNaseを含まないため泳動後の核酸抽出にも安心です。その他のアガロース製品はこちら A9539
10xTAEバッファー(トリス-酢酸-EDTAバッファー) DNase、RNase フリー   T9650
10xTBEバッファー(トリス-ホウ酸-EDTAバッファー) DNase、RNase フリー   T4415
ゲルローディングバッファー RNase フリー 泳動時にサンプルに対して1:3~1:6になるように添加します。 G2526
臭化エチジウム(EtBr)溶液 10 mg/mL溶液 アガロースゲルに臭化エチジウムを入れる場合に便利です。 E1510
臭化エチジウム(EtBr)溶液 0.5 mg/mL溶液 電気泳動後のゲルの染色に用いる場合は、水で0.5μg/mlに希釈して、15~30分間ゲルを浸漬します。 E1385
Trizma base(トリス塩基) DNase、RNase、Proteaseフリー トリスバッファーの調製によく使われています。 T6066
x-tracta Gel Extraction Tool   アガロースゲルからの簡便な切り出しツール。100個入り。 Z722390

核酸の分子量マーカー

アガロースゲル電気泳動では核酸が分子量によって分離され、その分子量を推定するため目的のサンプルと並行してあらかじめ分子量が分かっている分子量マーカーを泳動します。分子量マーカーとしてλDNAなどバクテリオファージDNAを制限酵素で切断したDNAや100bp、1kbといった特定のサイズのDNAが複数混合されたもの(ラダーマーカー)が一般的に用いられます。目的のサンプルDNAの予想されるサイズに応じてDNA分子量マーカーを選択します。製品一覧(英語サイト)もあわせてご覧ください。

 

主なDNAマーカー グレード 製品情報 製品番号
1 kbラダーマーカー Ready-to-use 約100回分。ゲルローディング溶液のため、そのままローディングできます。 D3937
100 bpラダーマーカー Ready-to-use 約75回分。ゲルローディング溶液のため、そのままローディングできます。 D3687
50 bpラダーマーカー Ready-to-use 約100回分。ゲルローディング溶液のため、そのままローディングできます。 D3812
広範囲用ラダーマーカー Ready-to-use 約100回分。ゲルローディング溶液のため、そのままローディングできます。 D7058
20 bpラダーマーカー   約80回分。Tirs-EDTA溶液。 P1598
λ DNA Hind III digest   20μg容量の場合20回分。Tirs-EDTA溶液。 D9780
φX174 DNA Hae III digest   20μg容量の場合40回分。Tirs-EDTA溶液。 D0672
 
RNAマーカー グレード 製品情報 製品番号
Transcript RNA Markers 0.2-10 kb   25回分。Tirs-EDTA溶液。非変性または変性アガロースゲル電気泳動に適しています。 R7020
Transcript RNA Markers 0.28-6.6 kb   25回分。Tirs-EDTA溶液。非変性または変性アガロースゲル電気泳動に適しています。 R7644

アガロースゲル電気泳動後のDNA抽出

アガロースゲル電気泳動を行ったDNAはゲルから回収してクローニングや制限酵素処理などに使用することがあります。DNAフラグメントを抽出する方法として、シリカメンブレンカラムを利用したキットによる高純度なDNAの精製法やアガロースゲルからスピンカラムによる簡易的な方法があります。

 

シリカメンブレンカラムによる抽出キット

GenElute™ ゲル抽出キット 製品番号NA1111(70回分)

  • DNAフラグメントを含むアガロースゲルを溶かし、シリカメンブレンカラムを用いて遠心によってDNAを精製
  • 通常のアガロースまたは低融点アガロースに使用可能
  • 10 μgまでのDNAを精製
  • 精製したDNAはシークエンス、クローニング、制限酵素処理、ラベリングなどに利用可能

アガロースゲルからのDNA抽出用スピンカラム

GenElute™ アガローススピンカラム 製品番号56500(70回分)

GenElute™ マイナスEtBrスピンカラム 製品番号56501(70回分)

  • DNAフラグメントを含むアガロースを切り出し、遠心によってDNAを抽出
  • マイナスEtBrスピンカラムは臭化エチジウムを含んだアガロースから臭化エチジウムを除去してDNAを分離
  • 100bp~10kbのDNAフラグメントを抽出
  • 精製したDNAは、クローニング、制限酵素処理、ラベリングなどに利用可能

臭化エチジウム(0.5 μg/mL)を含むアガロースゲルでDNAを電気泳動後、ゲルから切り出したバンドをマイナスEtBrカラム(56501)とアガローススピンカラム(56500)に入れてそれぞれ遠心。UV照射により溶出液を比較。マイナスEtBrカラム内のフィルターに臭化エチジウムは維持され、溶出液には見られない。

:GenElute™ Agarose Spin Column(アガローススピンカラム)

:GenElute™ Minus EtBr Spin Column(マイナスEtBrカラム)

タンパク質の電気泳動

ポリアクリルアミドゲルはアクリルアミドとビスアクリルアミド(N,N’-methylenebisacrylamide)から形成される高度に架橋したゲルマトリクスです。このゲルは電荷によって移動するタンパク質のふるいとして役割を果たします。ネイティブのタンパク質は全体として正または負の電荷を帯びているため電荷が釣り合う等電点まで移動します。変性したタンパク質は一律に負の電荷を帯びているため、正の電極に向かって移動し、それぞれのサイズに応じて分離します。

 

SDS-PAGEタンパク質電気泳動によく使用される試薬

製品一覧はこちら

 
主な製品 グレード 製品情報 製品番号
30%アクリルアミド/ビスアクリルアミド29:1溶液 電気泳動用 アクリルアミドゲルの作製に便利な溶液です。 A3574
2x LaemmLi サンプルバッファー   サンプルと本製品を1:1に混ぜ、2~5分間ボイルして電気泳動に用います。 S3401
トリス-グリシン-SDSバッファー(10x 泳動バッファー)     T7777
10% SDS溶液 DNase、RNaseフリー   71736
10%過硫酸アンモニウム溶液 電気泳動用   A3678
TEMED(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン) 電気泳動用   T9281
Trizma base(トリス塩基) DNase、RNase、Proteaseフリー トリスバッファーの調製によく使われています。 T6066

 

SDS-PAGEプレキャストゲル

TruPAGEは非常に強固なプレキャストゲルで、一般的なSDS-PAGEの電気泳動槽で泳動を行うことができます。泳動には専用のバッファー(TEA-TriceneまたはTEA-MOPS)が必要です。

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タンパク質電気泳動の分子量マーカー

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主な製品 グレード 製品情報 製品番号
着色済み広範囲マーカー
ColorBurst™ Electrophoresis Marker
8,000-220,000 Da 約50回分(ミニゲル)。Tris-グリシンまたはTris-トリシンSDS-PAGE用。 C1992
着色済み超低分子量マーカー
Color Marker Ultra-low Range
1,060-26,600 Da 約20回分(ミニゲル)。Tris-トリシンSDS-PAGE用。 C6210
SigmaMarker wide range 6,500-200,000 Da   S8445
SigmaMarker low range 6,500-66,000 Da   M3913
Kit for Molecular Weights 14,000-500,000 Non-denaturing   未変性電気泳動用 MWND500

タンパク質電気泳動の染色試薬

製品一覧はこちら。従来のCBB(クマシーブリリアントブルー)染色や蛍光染色など多数の製品をご用意しています。

 

CBB(クマシーブリリアントブルー)染色

主な製品 グレード 製品情報 製品番号
EZBlue™ ゲル染色液 Ready-to-use溶液 微量タンパク質の検出が可能。調製済み1x溶液(ブリリアントブルーG-250含有) G1041
Brilliant Blue G 濃縮液 1L調製用の濃縮液 希釈後の濃度:0.1% ブリリアントブルーG、25% メタノール、5% 酢酸 B8522
Brilliant Blue R 濃縮液 1L調製用の濃縮液 希釈後の濃度:0.25% ブリリアントブルーR、40% メタノール、7% 酢酸 B8647
Brilliant Blue R 染色液   0.5% ブリリアントブルーR、45% エタノール、10% 酢酸 B6529

 

銀染色

主な製品 グレード 製品情報 製品番号
ProteoSilver 銀染色キット   SDS-PAGE、二次元電気泳動のどちらにも使用可能
タンパク質検出限界 0.1 ng/mm2
1キット25回分(ミニゲルの場合)
PROTSIL1
ProteoSilver Plus 銀染色キット   ProteoSilver 銀染色キットに脱色用試薬を追加
グルタルアルデヒド不含
ゲル内トリプシン消化、MALDl-MS 解析に有用
1キット25回分(ミニゲルの場合)
PROTSIL2

 

蛍光染色

SYPRO®およびLUCY®は電気泳動したゲル内のタンパク質をCBBと同様に迅速かつ簡単に染色でき、銀染色と同等の高感度の検出力を示す蛍光色素です。

主な製品 グレード 製品情報 製品番号
SYPRO Orange Protein Gel Stain   λex 300、470 nm、λem 570 nm S5692
SYPRO Red Protein Gel Stain   λex 300、550 nm、λem 630 nm S5817
SYPRO Tangerine Protein Gel Stain   λex 300、490 nm、λem 640 nm S5942
SYPRO Ruby Protein Gel Stain   二次元SDS-PAGE用 S4942
LUCY 506(x5000溶液)   感度: 3 ng/バンド
リニアダイナミックレンジ(直線性): 3 - 1,000 ng/バンド
68721
LUCY 565(x5000溶液)   感度: 5 ng/バンド
リニアダイナミックレンジ(直線性): 5 - 4,000 ng/バンド
ウエスタンブロッティングに使うゲルの染色にオススメ
43772
LUCY 569(x5000溶液)   感度: 5 ng/バンド
リニアダイナミックレンジ(直線性): 5 - 6,000 ng/バンド
ダイナミックレンジが広く、ゲルでのタンパク定量にオススメ
41629
LUCY Starter Kit   LUCY 506、 565、 569 各50μLのセット 51153