Recombinant Protein Purification & Detection FLAGタンパク質発現システム

FLAG^® 発現システムは組換え融合タンパク質の発現、精製、検出用に確立されたシステムです。ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、タンパク質精製やタンパク質間相互作用、細胞の微細構造、タンパク質同定等、多くのアプリケーションで実績を残しています。このスモールサイズの親水性タグを使えば、特異性と感度にすぐれた弊社のANTI-FLAG^® 抗体での組換え融合タンパク質の検出、精製がさらに容易になります。

■ 実績−2,000 以上もの報告があります。
■ 超高感度−100 fmol のタンパク質を検出できます。
■ 包括的−多種フォーマットで使用できる完全システムです。

１. FLAG ,3xFLAG の概要 理想的なエピトープタグ 高感度検出 特異性の高い抗体 ワンステップ精製 細菌系と哺乳動物系に適したベクター FLAGによる染色例 ２. 製品一覧 ３. 技術情報 ４. トラブルシューティング

１. FLAG, 3xFLAG の概要

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理想的なエピトープタグ：スモールサイズ、親水性、切断可能

FLAG システムではFLAG ベクターにより目的タンパク質に融合して発現される短い8 アミノ酸の、親水性ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) を用いています。FLAG ペプチドには特異性の高いAnti-FLAG モノクローナル抗体（M1,M2, M5）およびポリクローナル抗体の結合部位があり、それぞれ異なる認識特性や結合特性を持っています。FLAG ペプチドは親水性なので融合タンパク質の表面付近に存在しやすくなっています。そのため、抗体の接近やエンテロキナーゼによる切断が容易です。加えてFLAG ペプチドは小さいので融合タンパク質の他のエピトープやドメインを覆ってしまったり、機能を変えたり、分泌、移動を阻害する可能性が少なく抑えられています。

3ｘFLAG システムは融合タンパク質に3 つのFLAG エピトープ（22 アミノ酸）をタンデムに融合させる改良システムです。3ｘFLAG を用いることにより検出感度は200 倍までに上昇します。発現量が低い場合、3ｘFLAG が最適です。従来のFLAG タグと同様に親水性でエンテロキナーゼ切断サイトを有し、22 アミノ酸と比較的小さいためタンパク質機能の変化、他のエピトープタグのブロック、溶解性の低下等の可能性は小さく抑えられています。

• FLAG発現システムの特徴（PDF 286kb）
• 3ｘFLAG発現システムの特徴（PDF 330kb）
• FLAG発現システムの操作手順（PDF 256kb）

FLAG タグと3ｘFLAG タグのアミノ酸配列

N 末端FLAG タグ（アミノ酸8 個）と3ｘFLAG タグ（アミノ酸22 個）は、タグのC 末端にあるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys 配列の下流でエンテロキナーゼに切断されます。

FLAG タンパク質発現システム

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高感度検出

■ 超高感度：他のどんなタグシステムに比べ20 ～ 200 倍の感度　(3xFLAG)
■ 検出感度：≦10 fmol　(3xFLAG)、≦100 fmol　(FLAG)
■ 哺乳動物細胞の低発現レベル遺伝子に最適　(3xFLAG)
■ FLAG の配列を3 回タンデムリピート　(3xFLAG)
■ 免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫細胞化学での検出を増強　(FLAG, 3xFLAG)

3ｘFLAG の感度比較

各々のタグをGST のC 末端にクローニング。精製した融合タンパク質を1µg から0.01ng まで希釈して分析。ウェスタンブロットでの各々のタグの検出限界を、それぞれの1 次抗体（推奨濃度に希釈）、2 次抗体としてHRP 標識Anti-Mouse IgG 、ECL 化学発光基質を用いて検出。

FLAG と3ｘFLAG のウェスタンブロットの感度比較

ニトロセルロースメンブレンに転写した3xFLAG-BAP* およびFLAG-BAP* のウェスタンブロット。1 次抗体にAnti-FLAG M2 モノクローナル抗体、2 次抗体にHRP 標識Anti-Mouse IgG を使用。ECL^™化学発光基質で検出した。(*BAP:Bacterial Alkaline Phosphatase)

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特異性の高い抗体

■ FLAG タグと3xFLAG タグの配列には、認識性と結合性がそれぞれに異なる高特異性のANTI-FLAG モノクローナル抗体（M1、M2、M5）、ポリクローナル抗体、複合体の結合部位が含まれています
■ ANTI-FLAG 抗体は、ほとんどの哺乳動物細胞および細菌細胞のライセートで交差反応をほとんど、またはまったく示しません

FLAG 融合タンパク質のAnti-FLAG M2 抗体による検出

Lane1: FLAG-BAP* コントロールタンパク質 Lane2: COS-7 細胞抽出液（ネガティブコントロール） Lane3: pFLAG-CMV-2-BAP* をトランスフェクションしたCOS-7細胞抽出液 *BAP : Bacterial Alkaline Phosphatase

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ワンステップ精製

■ たったワンステップのクロマトグラフィーでシングルバンドまで精製
■ 非変性条件下での精製
■ FLAG、3ｘFLAG 合成ペプチドによる単純で拮抗的な溶出
■ アフィニティゲルと96 ウェルプレートでの精製が可能

Anti-FLAG M2アフィニティゲル精製によるSDS-PAGEの結果

Anti-FLAG M2 アフィニティゲルで精製しpFLAG-ATS™ -BAPをトランスフェクトした大腸菌ライセートの SDS-PAGE。（クマシーブリリアントブルーで染色した） Lane1: 大腸菌ライセート（精製前） Lane2: 大腸菌ライセート（精製後）

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細菌系と哺乳動物系に適したベクター

■ 細胞質発現または分泌
■ T7 プロモーターまたはtac プロモーターの配列を有する細菌ベクター
■ FLAG タグ同様、3xFLAG タグも哺乳動物系に使用可
■ 二重タグ融合タンパク質が可能
■ N 末端FLAG タグ、3xFLAG タグのEk 切断部位で融合タグを切断できます
■ 哺乳動物細胞におけるバイシストロン性発現ベクターの新製品BICEP^™シリーズは、FLAG 融合タンパク質の効率的な安定発現と多重遺伝子発現を実現

細菌系と哺乳動物系に適したベクター

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FLAGによる染色例

FLAG-p53 and mock transfected COS-7 cells were permeabilized, fixed, blocked, and incubated with Anti-FLAG M2, affinity purified antibody.

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２. 製品一覧

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■ FLAGベクターの選択（細菌、哺乳類、昆虫） ■ 抗FLAG抗体

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３. 技術情報

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3.-1.　米国情報

■ FLAG Literature
■ Poster GalleryZ
■ Epitope Tags in Protein Research Mini Guide
■ Recombinant Protein Expression Workflow
■ RPE to BioNMR Workflow

3.-2.　プロトコール

3.-2.-1.　ベクターへの目的遺伝子の挿入

a）ベクター調整（PDF 239kb）
b）インサート調整（PDF 310kb）
c）ベクターへのインサートのクローニング（PDF 238kb）
d）陽性クローンの確認（PDF 306kb）
e）インサートの塩基配列決定（PDF 242kb）

3.-2.-2.　FLAG融合タンパク質の発現誘導（大腸菌、哺乳類、昆虫）

a）大腸菌（PDF 249kb）

• タンパク質発現宿主
• FLAG融合タンパク質を発現する形質転換体のスクリーニング
• 融合タンパク質発現の最適化

b）哺乳類細胞（PDF 236kb）

• トランスフェクション
• 一過性発現/安定発現
• FLAG融合タンパク質発現確認

c）昆虫細胞

3.-2.-3.　FLAG融合タンパク質の単離・精製・検出

a）細胞溶解（PDF 236kb）

• 大腸菌
• 哺乳類細胞

b）精製

• カラム法：抗FLAG M1アフィニティーゲル（PDF 239kb）
• カラム法：抗FLAG M2アフィニティーゲル（PDF 107kb）
• バッチ法：抗FLAG M2アフィニティーゲル（PDF 235kb）
• 免疫沈降法（PDF 237kb）
• FLAG融合タンパク質の溶出（PDF 237kb）

c）検出

• ウエスタンブロッティング
  間接免疫蛍光細胞化学染色（PDF 241kb）
• 免疫沈降（IP）
  Enzyme Immunoasay (EIA)
  ELISA検出
  ウエスタンブロッティング：抗FLAG M5抗体（PDF 238kb）

d）除去

• FLAGマーカー・FLAGペプチドの除去（PDF 283kb）
• エンテロキナーゼの除去（PDF 235kb）
• FLAG HA タンデムアフィニティー精製キットを用いた方法

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４. トラブルシューティング

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FLAG製品に関するトラブルシューティングはこちら

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