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プロテオミクス
血中多量タンパク質除去 Seppro アフィニティカラム
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血清・血漿中の多量タンパク質を抗原として、ニワトリに免疫し、その卵黄中に含まれた "ＩｇＹポリクローナル抗体" を精製し、ビーズに固定した、特異性の高いアフィニティーカラムです。
マイクロビーズの表面に、十分な血清/血漿に対する"アフィニティー精製された"Ig Yを一定方向に共有結合させています。抗原結合との特異性は、競合他社の持つヤギIｇGベースの技術に比べ高いです。
 図. ビーズイメージ |
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- 液クロ用レジン充填済みカラム（ＬＣ）
- スピンカラム（ＳＣ）
★それぞれ、ヒト用、マウス用、ラット用、植物用の4種があります。
★カラムはリサイクルで、100回使用できます。
Seppro®IgY14カラムは、ヒト血漿・血清中TOP14種の多量タンパク質（Highly abundant proteins:HAP）を除去することによって、低濃度タンパク質（LAP）の解析や、バイオマーカー探索に役立ちます。
さらに、中量タンパク質除去用カラム（SuperMix）を併用することにより、より効果的に、中～多量タンパク質を除去し、低濃度タンパク質（LAP）の検出感度を高めます。
IgY-14では、血清や血漿中の95％以上の多量タンパク質が除去でき、低濃度タンパク質の検出感度が20倍も増幅します。
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| 1. HAS |
2. IgG |
3. Fibrinogen |
4. Transferrin |
5. IgA |
| 6. IgM |
7. Haptogolobin |
8. alpha2-Macroglubulin |
9. alpha1-Acid Glycoprotein |
10. alpha1-Antitrypsin |
| 11. Apo A-I HDL |
12. Apo A-II HDL |
13. Complement C3 |
14. LDL ( ApoB ) |
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血清分画プロセス
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IgYを使用している理由
IgYは、IgGと比較して、抗原結合部位とFc部位が構造的に異なっています。それにより、ヒト血漿・血清中のIgM、補体、Fcレセプターなどとの交差が少なく、高特異性をもつことになります。
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表：IgYとIgGとの比較
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IgY |
IgG |
| 動物 |
ニワトリ(家禽） |
哺乳類 |
| 材料 |
卵黄 |
血漿 |
| 親和性 |
高い |
中程度 |
| 収量 |
大きい |
限られる |
| 交差性 |
低い |
高い |
| 精製 |
簡単 |
高コスト |
| 安定性 |
良い |
良い |
| 再現性 |
高い/早い |
低い/遅い |
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IgYは、IgGと比較して、抗原結合部位とＦｃ部位が構造的に異なっています。
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- ・ Human IgY14 Columns
- IgY14 カラムはヒト血清/血漿から14種類のタンパク質を除去します
- ・ Human Supermix System
- ヒトSupermix カラムは the IgY14 systemと一緒に使うときに、ヒト血清/血漿から適度に多量タンパク質を除去します
- ・ IgY Mouse-Specific Columns
- IgY マウス特異的カラムはマウス血清/血漿から7種の多量タンパク質を除去します
- ・ IgY Rat-Specific Columns
- IgYラット特異的カラムは ラット血清/結晶から7種の多量タンパク質を除去します
- ・ IgY RuBisCO Columns
- 植物抽出物からRubisco（Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）タンパク質を特異的に除去します
- ・ カスタム製品に関して
- ご相談させていただきます。お気軽に弊社までお問合せ下さい。（sialjpts@sial.com）
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- ・ FAQ
- ・ 参考文献
- ・ Evaluation of Methods for Removal of Highly Abundant Human Plasma Proteins (274kb PDF)
- ・ Further Development of IgY-Immunoaffinity Fractionation - SuperMix & SepproTip Technologies (6.87mb PDF)
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オーダーインフォメーション
| 製品番号 |
サンプル量 |
製品名 |
製品説明 |
レジン容量
/本数 |
| SEP010 |
ヒト血清・血漿 15-20μL |
Seppro IgY14 Spin Columns |
ヒト血清・血漿中のHSA, IgG, フィブリノーゲン, トランスフェリン, IgA, IgM, ハプトグロビン, α2-マクログロブリン, α1-酸性糖タンパク, α1-アンチトリプシン, HDL （アポA-I，アポA-II）, アポB, 補体C3の14種を除去します。 |
2本 |
| SEP020 |
ヒト血清・血漿 40-50μL |
Seppro IgY14 LC2 Column |
2mL/1本 |
| SEP030 |
ヒト血清・血漿 100μL |
Seppro IgY14 LC5 Column |
5mL/1本 |
| SEP040 |
ヒト血清・血漿 200-250μL |
Seppro IgY14 LC10 Column |
10mL/1本 |
| SEP050 |
IｇYカラム（IgY14 LC5）からの
通過分画用 |
Seppro Supermix LC2 Column |
ヒト血清・血清用IgY14の通過画分から、さらに中量含有タンパク質を除去します。 |
2ｍL/1本 |
| SEP060 |
IｇYカラム（IgY14 LC10）からの
通過分画用 |
Seppro Supermix LC5 Column |
5mL/1本 |
| SEP110 |
マウス血清・血漿 10μL |
Seppro Mouse Spin Columns |
マウス血清・血漿中のアルブミン, IgG, フィブリノーゲン, トランスフェリン, α1-アンチトリプシン, ハプトグロビン, IgM の7種を除去します。 |
2本 |
| SEP090 |
マウス血清・血漿 150μL |
Seppro Mouse LC10 Column |
10mL/1本 |
| SEP100 |
マウス血清・血漿 10μL |
Seppro Supermix Mouse
LC5 Column |
MouseLC5の通過画分から、さらに中量含有タンパク質を除去します。 |
5mL/1本 |
| SEP120 |
ラット血清・血漿 200μL |
Seppro Rat LC10 Column |
ラット血清・血漿中のアルブ, IgG, フィブリノーゲン, トランスフェリン, α1-アンチトリプシン, ハプ トグロビン, IgMの7種を除去します。 |
10mL/1本 |
| SEP130 |
ラット血清・血漿 15-20μL |
Seppro Rat Spin Columns |
2本 |
| SEP070 |
Rubisco ～0.2ｍｇ |
Seppro Rubisco Spin Columns |
植物中に含まれるRubisco（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase） を除去します。 |
2本 |
| SEP080 |
Rubisco ～1ｍｇ |
Seppro Rubisco LC2 Column |
2mL/1本 |
- ・ カスタム製品に関して
- ご相談させていただきます。お気軽に弊社までお問合せ下さい。（sialjpts@sial.com）
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FAQ（良くあるご質問）
- 1. Seppro®製品にははどんなフォーマットがありますか？
- スピンタイプとLCカラムタイプがあります。また、自動化用チップもあります。
- 2. Seppro®製品はどんなところが優れていますか？
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- 目的タンパク質を高特異的に捕捉
- ターゲットとの強固な結合力
- 優れたパフォーマンス（＞95％効率）
- 異なるアプリケーション間での柔軟性
- すばらしい再現性とリサイクル性
- 3. Seppro®の推奨使用方法は何ですか？
- Seppro®は、14種の多量タンパク質（Highly abundant proteins:HAP）を除去することによってタンパク質を分画する、イムノアフィニティーカラムです。
多量タンパク質を除去することにより、少量タンパク質（Low abundant proteins: LAP）の解析や、バイオマーカー探索に役立ちます。 - 4. Seppro®の使用は、どのような研究に一番向いていますか？
- Seppro®で多量タンパク質（HAP）を除去することによって、今までマスクされて扱いにくくなっていた微量タンパク質（LAP）の二次元電気泳動(２DE)やマススペクトロメトリー（MS）解析を行うことができます。
- 5. Seppro®を用いてサンプル処理後、使える迅速なアッセイ法はなんですか？
- SDS-PAGE、2D-Gel、MALDI-TOF、LC-MS/MS
- 6. Seppro®製品は、プロテオミクスのサンプル処理用アフィニテー分離製品として、どのようなものなのでしょうか？ また、他社の製品と比較してどのように違いますか？
- Seppro®は、免疫沈降用にデザインされた、マイクロビーズの上に、特異性の高いIg Yを一定方向に共有結合させたものです。抗原結合と特異性は、競合他社のヤギIgG製品よりも高いです。Seppro®はラットやマウスやイヌの血清からアルブミン、フィブリノーゲン、トランスフェリンのような非ヒト哺乳類抗原を特異的に分離します。これはトキシコプロテオミクスやバイオマーカー探索や動物病態モデルの形成などに十分効果を発揮するでしょう。
- 7. 多量血漿タンパク質（HAP）はどのくらいSeppro®で除去できるのですか？
- Ig Y-14カラムでは95％以上の多量タンパク質が除去でき、バイオマーカー探索において、未処理の血清や血漿を用いるのと比べて、20倍も増幅できます。
- 8. IgY-14カラムを使用したプロテオミクスでバイオマーカー候補を発見した後、シグマにどのようなサービスを期待できますか？
- バイオマーカー候補タンパク質に対して、遺伝子特異的Ig Y抗体を製造、ご提供することが可能です。これらはウェスタンブロット、IP、IHC、セルソーティングや他のイムノアッセイに有用です。
- 9. Seppro®製品の保存はどのようにすればいいのですか？
- 本アフィニティーカラムは2-8℃で保存してください。微生物の繁殖を防ぐため、長期間の保存では、0.02%アジ化ナトリウムを希釈バッファーに加えてカラムに入れてください。他の全てのキットコンポーネント（バッファー、スピンカラム、コレクションチューブなど）は室温で保存してください。
- 10. サンプルの前処理（ろ過、脱塩）などは必要ですか？
- LCカラムを詰まらせないために、希釈バッファーでの希釈後、血清や血漿サンプルは予め0.45μmスピンフィルターでろ過して、粒子や残渣（フィブリンの血餅など）を取り除いてください。
- 11. どんな種（ヒト、イヌ、サル、ラットなど）の血漿や血清にも使えますか？
- IgY-14抗体が結合したマイクロビーズの混合物はヒトや霊長類の血清や血漿に最適化されています。多くのこれら抗体は他の哺乳類種からのオーソロガスタンパク質に高い交差性があるので、異なる量と比率をもつ非ヒト／霊長類サンプルでは、IgY-14のご使用をお勧めしません。 ヒト以外（マウス、ラット、植物など）専用Sepproカラムも準備してありますので、そちらをご利用下さい。
- 12. アルブミンや多量タンパク質を回収できますか？
- IgYマイクロビーズカラムで捕捉した多量タンパク質の回収とその後の分析はとても簡単にできます。血漿タンパク質90％以上含む2番目に溶出されたピークを集めて、中和バッファーを1/10量加えてください。その後、超ろ過により濃縮するか、エタノールやTCA、アセトンで沈殿させてください。
- 13. 他のタンパク質はどんなものが除去できるのですか？
- 現在の方法ですと、イムノアフィニティー捕捉よりもっと特異性が高い技術はありません。ここで列挙された特異的タンパク質だけが、血清や血漿サンプルから除去されます。
- 14. IgYマイクロビースの物理的特性は何ですか？
- IgY製品に使われている固形支持体は、親水性、電荷フリー、高収容能、高架橋、硬質、共重合体、そして、多孔性です。サンプルとの非特異結合を最小現にします。中圧液体クロマトグラフィーに適応します。
- 15. カラムの消耗はどのように判断すればいいんですか？
- カラムは100回程度リサイクルできます。100回使った後、カラムを捨ててください。抗体の特異性とキャパシティーが継続して使用可能かどうかはクロマトグラムの形、1D SDS-PAGEまたはマス解析などによって判断します。
- 16. カラムは再生できますか？
- 結合、洗浄、溶出、中和と再平衡の5つのステップには、3種のバッファーを用いて行います。一般的には、パススルーまたは、分画したピークや、結合／溶出したピークを集めます。100サイクル使用した後にカラムを捨ててください。
- 17. ランタイムはどのくらいですか？
- カラムを装着したLC装置によりますが、普通の流速で、一般的にLC2 (2mLゲル) は48分かかります。また、LC10 (10mLゲル)で70分かかります。
- 18. バッファーは自作のものを使用してもよいですか？
- もちろんです。希釈と中和バッファーは標準です。特に、除去バッファーを作る際にはpHメーターで正確に測定してください。カラムに結合しているIgY抗体の酸変性を避け、結合タンパク質を除去するためには、pH 2.5であることが重要です。
- 19. どんなLCシステムでもカラムは使用できますか？
- はい。LCカラム添付の標準の1/4-28フィッティングがFPLC (M6フィッティング) または、HPLC (10-32フィッティング）に最適です。Tefzelをご使用になることをお勧めします。TeflonまたはPEEK素材は、１/１6"ODの内側外側チューブです。有機バッファーを全て最初に除去したのを確かめてから、システムをご使用前にProteomeLabキットのバッファーで平衡してください。
- 20. 脊髄液（CSF）、尿、他の生体液にこれを使用することはできますか？
- はい。ヒトサンプルは、カラムにインジェクションする前に、0.45μｍスピンフィルターを通して、微粒子を取り除いてください。キャパシティーが最適化されて、これらサンプルは良く分離できます。
- 21. 低温室でこれは使用できますか？
- はい。しかし、必須ではありません。
- 22. バッファーに界面活性剤が入っていますか？
- どのバッファーにも界面活性剤、尿素、他のカオトロピック試薬または保存剤は入っていません。本製品のIgYマイクロビーズには、抗微生物保存剤として0.02％アジ化ナトリウムが入っているだけです。
- 23. 分析前に、パススルー分画からバッファー置換する必要がありますか？
- パススルー分画はTBS（Tris-Buffered Saline）です。この分画（それと結合、溶出分画）中のタンパク質はスピン超フィルトレーション膜、エタノール・アセトン・TCA沈殿などで濃縮することが可能です。
- 24. サンプル間の持ち越しはありますか？
- カラムを適切にリサイクルした後にマス解析しても、タンパク質は全く検出されませんでした。最適な除去処理をすれば、カラムにタンパク質が残ることはありません。
- 25. 各タンパク質の何％が除去されますか？
- IgYの各コンポーネント除去効率は次のとおりです。
HAS, IgG, Transferrinの除去率は99％以上
Haptoglobin, α1-Antitrypsin, IgA.、ApoAI, Apo A IIの除去率は95％以上
2 Macrogluline, IgM, α1 Acid GlycoproteinおよびFibrinogenなど、90％以上除去します。 - 26. 回収率はいくらですか？
- IgY-14ラットカラムを使ったとき、全霊長類の血漿タンパク質の5-10％程度は、パススルーまたは分画で回収されます。
- 27. 25回使用した後、IgYマイクロビーズを新しいスピンカラムに移す必要はありますか？
- IgYマイクロビーズレジンは適切な使用で100回の使用に耐えられますが、スピンカラムは30回前後使用あたりに、残渣などによるスピンカラムの目づまりにより、流速が落ちることがあります。そこで、25回使後に新しいスピンカラムに、１ｍLの使い捨てのピペットチップで50％ゲル全量を移すことをお勧めします。この移す操作を3回（25回目、50 回目、75回目）繰り返すことによって、このスピンカラムレジンは100回まで、使用可能になります。この単純な操作は、溶出バッファーに、尿素のようなカオトロピック試薬を入れるよりも、もっと有効です。
- 28. IgY-14やHASスピンカラムを用いて分画されたタンパク質の全回収率（1回の使用あたり、スピンカラムあたり、キットあたりの全回収率）はいくらですか？
- IgYスピンカラムの血清・血漿ロード収容量は10μLです。全血清・血漿タンパク質量を70-80mg/mLと考えると、IgY14スピンカラムには700-800μgをロードできます。全タンパク質の90％がIgY-14カラムに結合して、溶出量は720μgとなります。全タンパク質の約10％がパススルー分画に存在してしまい、14種の多量タンパク質、約80μgが除去されます。各スピンカラムは100回使用できるので、全回収率は分画タンパク質の～8mgです。キットには２つカラムが入っていますので、各IgY14スピンカラムキットには約16mgのIgY14各分画タンパク質が回収されます。
- 29. 多量タンパク質の除去だけではなく、血清アルブミンに何が生理的に結合するのか、興味があります。Sepproはこのアプリケーションに適していますか？
- 抗HSA IgYに結合している血清タンパク質複合体は抗HASモノクローナルIgGカラムよりも特異的です。これはIgYのFc部分に結合するバックグラウンドがIgGに比べて少ないことから、効果的なAlubuminomicsが可能です。シグマの抗HAS IgYを試した全てのラボではこの優れた特異性に大変満足しています。
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シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社
ライフサイエンス事業部
〒140-0002 東京都品川区東品川2-2-24 天王洲セントラルタワー4F
- 製品に関するお問合せは、弊社テクニカルサポートへ
- TEL：03-5796-7330 ／ FAX：03-5796-7335 ／ E-mail：sialjpts@sial.com
- 在庫紹介・ご注文方法に関するお問合せは、弊社カスタマーサービスへ
- TEL：03-5796-7320 ／ FAX：03-5796-7325
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