Attention:

Certain features of Sigma-Aldrich.com will be down for maintenance the evening of Friday August 18th starting at 8:00 pm CDT until Saturday August 19th at 12:01 pm CDT.   Please note that you still have telephone and email access to our local offices. We apologize for any inconvenience.

Slovensko

Fluorescenčná in situ hybridizácia FISH

Metódou fluorescenčnej in situ hybridizácie sa dá lokalizovať cieľová nukleotidová sekvencia priamo v bunkách (in situ). Metóda FISH je založená na schopnosti jednoreťazcovej DNA sondy viazať komplementárny úsek cieľovej DNA fixovanej na mikroskopickom skle.

Inkorporácia fluorescenčne značených nukleotidov do DNA sa zvyčajne uskutočňuje metódou nick translácie, in vitro transkripcie, „random primer“ alebo metódou polymerázovej reťazovej reakcie.

Cieľovú DNA a DNA sondy je nutné denaturovať. Denaturácia sa uskutočňuje vo formamidovom roztoku pri teplote 65-70 °C. Hybridizáciou, ktorá prebieha pri 37 °C, sa jednoreťazcová DNA sonda viaže na komplementárny úsek cieľovej DNA.

Po odstránení nešpecificky naviazanej sondy sa signál detekuje napr. protilátkou.

Reagencie a zariadenia

  1. 1. 20xSSC pufer (SSC: 3 M NaCl, 0.3 M citrát sodný, pH 7 alebo katalóg. číslo S6639).
  2. RNáza A (katalóg. číslo R4642) 100 µg/ml v 2x SSC.
  3. Pepsín (katalóg. číslo P6887) 40 jednotiek/ml v 10 mM HCl (katalóg. číslo H7020).
  4. Paraformaldehyd  (katalóg. číslo P6148) čerstvo depolymerizovaný, 4% w/v vo vode.
  5. Etanol.
  6. Značená sonda. Plazmidová DNA značená biotín-11-dUTP (katalog. číslo B6780)
  7. ADVANCE™ Nick Translation Kit, katalog. číslo NICK-A1).
  8. Roztok hybridizačnej zmesi: 50% formamid (katalog. číslo F7508), 10% dextrán sulfát (katalóg. číslo D8906), 0.1% SDS (katalóg. číslo L4390), 0.5-1.5 ng/µl značená sonda a 300 ng/ml DNA zo spermií lososa (katalog. číslo D7656) v 2x SSC.
  9. Premývací pufer: 20% formamid (katalóg. číslo F7508) v 0.1x SSC.
  10. Detekčný pufer: 0.2% Tween 20 (katalóg. číslo P1379) v 4x SSC.
  11. Blokovací pufer: 5% BSA (katalóg. číslo A 3803) v detekčnom pufri.
  12. Protilátka  alebo iné detekčné reagencie (napr. Streptavidín-Cy3, katalóg. číslo S6402) v blokovacom pufri .
  13. DAPI (katalog. číslo D9542) 2 µg/ml v “antifade” montovacom médiu.
  14. Fluorescenčné filtre (napr. x58, Omega Optics).
  15. Mikroskopické sklá (katalog. číslo S8400).
  16. Krycie sklíčka.
  17. Termoblok.
  18. Kyvety na premývanie skiel (katalog. číslo S6016, S5641 nebo S5891).

Postup

Príprava skiel

  1. Pripravte cytogenetické preparáty.
  2. Inkubujte s 200 µl RNázy 1 hodinu pri 37 °C.
  3. Premyte sklá v 2x SSC  5 minút, premývanie opakujte.
  4. Premyte sklá v 10 mM HCl.
  5. Inkubujte 10 minút s  200 µl pepsínu pri  37 °C.
  6. Premyte sklá deionizovanou vodou.
  7. Premývajte sklá v 2x SSC  5 minút, premývanie opakujte.
  8. Stabilizujte sklá 10 minút v paraformaldehyde.
  9. Premývajte sklá v 2x SSC  5 minút, premývanie opakujte .
  10. Dehydratujte sklá v vzostupnom alkoholovom rade (3x2 minuty v  70%, 80%, 95% etanolu).
  11. Nechajte uschnúť

 

Hybridizácia

  1. Pripravte hybridizačný roztok (30 µl  na 1 sklo). Zahrejte 10 minút na 70 °C a potom umiestnite na ľad.
  2. Naneste 30 µl hybridizačneho roztoku na každé sklo a prikryte plastovým krycím sklíčkom.
  3. Preparát ďalej denaturujte pri 65-70 °C po dobu  5 minút na termobloku.
  4. Postupne znižujte teplotu až na 37 °C.
  5. Hybridizujte cez noc vo vlhkej komôrke pri 37 °C.


Detekcia

  1. Premyte sklá v 2x SSC, odstráňte krycie sklá.
  2. Premývajte premývacím pufrom 5 minút pri 40 °C, premývanie opakujte.
  3. Premývajte sklá v 0.1x SSC pri 40 °C, 5-15 minút.
  4. Premývajte sklá v 2x SSC pri 40 °C, 5-15 minút.
  5. Ochlaďte sklá na izbovú teplotu.
  6. Ekvilibrujte sklá v detekčnom pufri po dobu 5 minút.
  7. Sklá umiestnite do blokovacieho pufru na dobu 20-30 minút.
  8. Inkubujte 30-60 minút s 50 µl protilátky (napr. 5 µg/ml Streptavidín-Cy3 v blokovacom pufri).
  9. Premývajte sklá v 2x SSC po dobu 5 minút., premývanie opakujte 2x.
  10. Zafarbite preparát  roztokom DAPIm, 10 minút.
  11. Rýchlo premyte a naneste tzv. antifade montovacie médium.
  12. Vyhodnoťte pod flouorescenčným mikroskopom.


Reference

  1. Heslop-Harrison, J.S., et al., Technique, 3, 109 (1991).
  2. Leitch, A.R., et al., in: In situ Hybridization, Bios Scientific Publishers, Oxford, England (1994).
  3. chwarzacher, T., et al., in: Plant Cell Biology: A Practical Approach, Harris, N., and Oparka, K.J. (eds.), Oxford University Press, Oxford, England, pp. 127 (1994).