Slovensko

Imunoblotting (Western blotting)

Elektroforetický prenos bielkovín zSDS-PAGE (elektroforéza vpolyakrylamidovom géli vprítomnosti dodecylsulfátu sodného) na nitrocelulózovú membránu, nylonovú membránu alebo PVDF, nazývame Western blotting.

Reagencie a zariadenia

  1. Transferový pufer:
    8 ml koncentrátu, ktorý sa skladá z 15,1 g TRIS a 72,1 g Glycínu rozpustených v 500 ml deionizovanej vody
    20 ml Metanolu
    1 ml 10% SDS
    doplniť vodou do 100 ml
  2. PBS pufer – pre 20x koncentrovaný zásobný roztok rozpustíme 80 g NaCl,
    35.8 g Na2HPO4.12 H2O a 15.6 g NaH2PO4 . 2 H2O a doplníme vodou do 1000 ml.
  3. Nitrocelulózové (NC), nylonové alebo PVDF membrány s veľkosťou pórov 0.45 μm, prípadne membrány s veľkosťou pórov 0.2 μm pre nižšie molekulové hmotnosti. Filtračný papier pre blotting (extra tenký) (katalóg. číslo P4431).
  4. Primárna protilátka proti hľadanému antigénu/proteínu.
  5. Sekundárna protilátka značená alkalickou fosfatázou alebo peroxidázou.
  6. Roztok pre blokovanie nešpecifických interakcií: 5% hovädzí sérový albumín (BSA) (katalóg. číslo A9647) vTBS alebo PBS alebo odtučnené sušené mlieko (katalóg. číslo M7409).
  7. Substrát pre alkalickú fosfatázu: ako napr. BCIP/NBT substrát - tablety (katalóg. číslo B5655) alebo tekutý (katalóg. číslo B1911, B3679, B3804).
    Substrát pre peroxidázu: ako napr. AEC farbiaci kit (katalóg. číslo AEC-101),TMB tekutý substrát pre membrány (katalóg. číslo T0565) alebo DAB tablety (katalóg. číslo D4418). Pre chemiluminiscenciu – CPS (CPS 160).
  8. Zariadenie pre blotovanie - semi-dry blotter (okrem toho je možné blotting uskutočniť vzariadení typu wet alebo dry blotter, presné návody sú dodávané výrobcami).
  9. Elektrický zdroj.
  10. Trepačka, najlepšie skývavym, pomalým pohybom.

     

Postup

SDS-PAGE
Uskutočnite SDS-PAGE delenie proteínov danej vzorky spoužitím komerčnej aparatúry. Naneste zodpovedajúce množstvo proteínov (v jednotkách mikrogramov zmesi) na gél a uskutočnite delenie podľa návodu dodaného výrobcom.

Prenos - blotting bielkovín

  1. Nechajte nasiaknúť akrylamidový gél po elektroforéze vtransferovom pufri 15 minút.
  2. Zostavte "sandwich" pre transfer bielkovín z akrylamidového gélu na membránu a to nasledovne vporadí od anódovej (+) platne:
    -3 vrstvy papieru pre blotting navlhčeného vtransferovom pufri;
    -NC membrána navlhčená deionizovanou vodou. PVDF membránu je najprv nutné navlhčiť vmetanole a potom vtransferovom pufri;
    -akrylamidový gél po elektroforéze;
    -3 vrstvy papieru pre blotting navlhčeného vtransferovom pufri;
    -pri prikladaní gélu na membránu je dôležité, aby vstyčnom priestore nezostali bublinky vzduchu, preto je vhodné gél jemne pritlačiť na membránu sklenou tyčinkou alebo pipetou;
  3. Uskutočnite transfer pri hodnotách napätia a prúdu doporučených výrobcom aparatúry.
  4. Vyberte membránu z aparatúry a pokračujte imunodetekciou.

Pri všetkých manipuláciach smembránou používajte ochranné rukavice, aby nedošlo ku kontaminácii membrány.

Imunodetekcia

Inkubácia a premývanie sa uskutočňuje pri laboratórnej teplote, najlepšie na trepačke spomalým, kývavym pohybom. Na zníženie nešpecificity je vhodné nariediť primárnu protilátku roztokom 1% normálneho séra vTBS alebo PBS (sérum zvieracieho druhu identického spoužitou sekundárnou protilátkou). Môžu sa použiť aj iné neinterferujúce bielkoviny, napríklad BSA, odtučnené sušené mlieko, želatína, hemoglobín, ovalbumín.

  1. 1.Vložte membránu do Petriho misky vhodného rozmeru (podľa veľkosti použitého gélu) nahore tou stranou, ktorá bola v styku sgélom pri prenose bielkovín.
  2. Blokujte membránu použitím blokovacieho roztoku, cez noc pri 4 °C alebo 2 hodiny pri laboratórnej teplote.
  3. Odstráňte blokovací pufer (odsatím za mierneho vákua).
  4. Membránu vložte do vhodného objemu, napr. 5 ml primárnej protilátky vhodne nariedenej (zvyčajne 1:500 - 1:10 000) v TBS alebo PBSpufri. Inkubujte 1-3 hodiny pri laboratórnej teplote na trepačke skývavym pohybom.
  5. Premyte membránu 4x po dobu 5 minút vdostatočnom množstve TBS/Tween alebo PBS/Tween.
  6. Inkubujte membránu 1 hodinu vo vhodne nariedenom roztoku sekundárnej protilátky značenej alkalickou fosfatázou alebo peroxidázou v TBS/Tween alebo PBS/Tween.
  7. Premyte membránu ako vbode5. Opláchnite 3x v TBS po dobu 5minút.
  8. Pripravte zvolený substrát pre alkalickú fosfatázu alebo peroxidázu podľa príslušných inštrukcií, ak nie je pripravený pre priame použitie.
  9. Inkubujte membránu vsubstrátovom roztoku 10-30 minút, kým nedôjde kzafarbeniu.
  10. Zastavte reakciu premytím membrány vdestilovanej vode (niekoľkokrát).
  11. Membránu vysušte na vzduchu a skladujte pri 2-8 °C medzi dvoma vrstvami filtračného papiera.


Poznámka : Pri použití chemiluminiscenčných substrátov pre peroxidázu (ako napr. ProteoQwest™ Chemiluminescent Western Blotting Kit, PQ0201) sa pracovný roztok sekundárnej protilátky nariedi5-10x viac, ako keď sa pracuje sbežnými kolorimetrickými substrátmi.


Literatúra

  1. Burnette, W.N., Anal. Biochem., 112, 195-203 (1981).
  2. Hames, B.D., and Rickwood, D. (eds.), "Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach", IRL Press Ltd., Oxford (1981).
  3. Gershoni, J.M., and Palade, G.E., Anal. Biochem., 131, 1-15 (1983).