Slovenska

Imunohistochémia

Imunohistochemické farbenie je cenná metóda na detekciu špecifických antigénov v tkanivách. Z dôvodu štandardnosti metódy sa najprv tkanivové rezy odparafínujú, následne sa pred aplikáciou primárnej protilátky rehydratujú. Potom sa aplikuje enzýmom konjugovaná (značená) sekundárna protilátka a špecifické zafarbenie sa zviditeľní po pridaní enzým-špecifického substrátu (tzv. nepriama imunohistochémia, pri priamej metóde je primárna - špecifická protilátka priamo značená enzýmom). Ak farbenie neprebieha alebo je slabé, demaskuje sa antigén (zablokované epitopy) pomocou digescie proteolytickými enzýmami alebo inkubáciou v mikrovlnnej rúre.
Nasledujúce metodiky popisujú aplikácie konjugátov s peroxidázou alebo alkalickou fosfatázou pri imunohistochemickom značení formalínových alebo parafínových tkanivových rezov.

Reagencie a zariadenia


  1. Formalínom fixované, parafinové tkanivové rezy.
  2. 0.01 M fosfátový fyziologický roztok, pH 7.4 (PBS) (katalóg. číslo P3813 alebo P4417 - tablety).
  3. Hovädzí sérový albumín (BSA) (katalóg. číslo A9647)
  4. Zrieďovací roztok: 1% BSA v PBS (katalóg. číslo P3688)
  5. Xylén (Fluka katalóg. číslo 95692)
  6. 0.1% Trypsín (katalóg. číslo T7409) v PBS alebo Trypsín - tablety (katalóg. číslo T 7168) v 4mM CaCl2, 200 mM TRIS, pH 7.7, alebo iný 0.1% proteázový roztok  v PBS.
  7. Antigén - vyvolávací roztok pre mikrovlnnú rúru: 10 mM citrát sodný (katalóg. číslo C8532) - pufer pH 6.0, 1 mM EDTA (katalóg. číslo ED4SS) pH 8.0.
  8. Primárna-špecifická protilátka
  9. Variant 1: Biotinylovaná sekundárna protilátka a extravidín-peroxidáza (katalóg. číslo E2886) alebo extravidín-alkalická fosfatáza (katalóg. číslo E 2636).
    Variant 2: Sekundárna protilátka značená  peroxidázou  alebo alkalickou fosfatázou.
  10. 3% peroxid vodíka (v deionizovanej vode, čerstvo pripravený z 30% roztoku) (katalóg. číslo H0904) - na použitie  peroxidázou značenej sekundárnej protilátky  alebo extravidín-peroxidázy.
  11. Enzýmový substrát: závisí na type  enzýmu a  požadovanom zafarbení (pozri skupinu Substráty).
    Pre peroxidázu: napr. AEC Staining Kit (katalóg. číslo AEC-101), DAB (katalóg. číslo D4418 alebo D0426).
    Pre alkalickú fosfatázu: napr. Fast Red TR/Naphtol AS-MX (katalóg. číslo B5655).
  12. Hematoxylín (Mayer's hematoxylin, katalóg. číslo MHS-1)
  13. Nádoba na farbenie (Coplin staining jars, katalóg. číslo S5641).
  14. Mikrovlnná rúra.
  15. Mikroskop.

Postup

Príprava sklíčok
Odstránenie parafínu a rehydratácia

  1. Umiestnite sklíčka s preparátom do termostatu na 56-60 °C na 15 min. (Upozornenie: teplota nesmie presiahnuť 60 °C).
  2. Preneste preparát do  xylénoveho kúpeľa  (2x 5minút s výmenou xylénu).
  3. Zbavte sa  nadbytku tekutiny a rehydratujte preparát v čerstvom bezvodom etanole s dvomi výmenami, vždy na 3 min.
  4. Zbavte sa  nadbytku tekutiny a vložte preparát do čerstvého 90% etanolu na 3 min.
  5. Zbavte sa  nadbytku tekutiny a vložte preparát do čerstvého 80% ethanolu na 3 min.
  6. Opláchnite preparát zľahka pod tečúcou vodou, 30 s (vyhnite sa priamemu prúdu, ktorý môže „vymyť“ alebo „uvoľniť“ rez).
  7. Vložte do PBS na ďalšiu  rehydratáciu (30 min. pri laboratórnej teplote)


Demaskovanie antigénu – „revitalizácia“

Poznámka: Tento krok sa uskutočňuje iba v prípade ak sa preparát nefarbí,  farbenie je slabé alebo demaskovanie je potrebné vzhľadom na špecificitu  primárnej protilátky. Tu sú uvedené niektoré možné spôsoby v závislosti na  protilátke a antigéne:

Enzymatická metóda:

  1. Aplikujte 0.1% trypsín v PBS alebo iný 0.1% roztok proteáz v PBS po dobu 2- 30 min. pri 37 °C. Predĺženie inkubačnej doby môže zvýšiť špecifické farbenie (dlhá doba digescie však vedie i k poškodeniu ). Opláchnite v PBS (10 min).


Mikrovlnná metóda:

  1. Premyte preparát deionizovanou vodou a umiestnite ho do umelohmotnej nádoby (vhodnej pre mikrovlnné aplikácie)  obsahujúcej vyvolávaci roztok pre antigén. Skontrolujte či sú preparáty úplne prevrstvené roztokom.
  2. Nastavte mikrovlnnú rúru na pracovné parametre: napr. 5 min. a výkon  ~700 wattov. Skontrolujte, či sú preparáty prekryté vyvolávacim roztokom, event. pridajte čerstvý roztok a inkubáciu zopakujte.
  3. Tento krok sa môže opakovať  2-3 krát.
  4. Nechajhte pozvoľna ochladiť pri laboratórnej teplote aspoň 20 min. pred nasledovným krokom.


Inaktivácia endogénnej peroxidázovej aktivity

Poznámka: Tento krok sa uskutočňuje iba v prípade použití peroxidázových konjugátov alebo extravidín-peroxidázy.

  1. Umiestnite preparáty na vodorovnú podložku tak, aby se navzájom nedotýkali. Zabráňte vyschnutiu preparátov.
  2. Pridajte dostatočné množstvo  3% peroxidu vodíka tak, aby boli zakryté celé preparáty (rezy).
  3. Inkubujte 5 min. pri laboratórnej teplote. 
  4. Opláchnite s PBS.
  5. Umiestnite preparáty do kúpeľa s PBS na 2 min.


Primárna protilátka – reakcia

Upozornenie:

  1. Inkubácia preparátu s 5% BSA po dobu 10 min. pred aplikáciou primárnej protilátky môže znížiť úroveň pozadia pri farbení. Pri práci so živočíšnymi tkanivami sa použije  5 až 10% normálne sérum rovnakého živočíšneho druhu, ako je sekundárna protilátka.
  2. Optimálne riedenie a inkubačnú dobu je vhodné stanoviť pre každú primárnu  protilátku pred jej použitím.

     

    1. Odstráňte prebytočnú kvapalinu (napr. trepaním) a opatrne otrite okolie rezu.
    2. Narieďte primárnú protilátku alebo negatívnu kontrolu podľa optimálneho riedenia. Zrieďovaci roztok sám môže byť použitý ako negatívna kontrola. Ako pozitívna kontrola môže byť použité známe tkanivo obsahujúce študovaný antigén.
    3. Aplikujte 100 μl roztoku primárnej protilátky na príslušné sklíčko s tkanivovým rezom; pokryte rez.
    4. Naklonením sklíčka  v rôznych smeroch rozmiestnite roztok  rovnomerne po preparáte.  
    5. Inkubujte aspoň 60 min. pri 37 °C vo vlhkej komôrke. Dlhšie inkubácie sa doporučujú pre antigény s nižšou hustotou výskytu.
    6. Opláchnite optarne s PBS. Umiestnite preparát do premývacej nádoby s PBS  na 5 min.


Sekundárna protilátka – aplikácia

Variant 1 – detekcia s biotínom/extravidínom

  1. Odstráňte prebytočnú kvapalinu (napr. trepaním) a opatrne otrite okolie rezu.
  2. Narieďte  biotinylovanú sekundárnu protilátku zrieďovacim roztokom na optimálnu koncentráciu. 
  3. Aplikujte 100 μl na každý preparát; pokryte rez.
  4. Naklonením sklíčka  v rôznych smeroch rozmiestnite roztok  rovnomerne po preparáte.  
  5. Inkubujte vo vlhkej komôrke aspoň 30 min. pri laboratórnej teplote.
  6. Opláchnite opatrne s PBS.
  7. Umiestnite preparát do premývacej nádoby s PBS  na 5 min

 
reakcia s extravidínom

  1. Odstráňte prebytočnú kvapalinu (napr. trepaním) a opatrne otrite okolie rezu.
  2. Narieďte extravidín peroxidázu alebo extravidín alkalickú fosfatázu.  Zrieďovacím roztokom na optimálnu koncentráciu.
  3. Aplikujte 100 μl na každý preparát; pokryte rez.
  4. Naklonením sklíčka v rôznych smeroch rozmiestnite roztok rovnomerne po preparáte.  
  5. Inkubujte vo vlhkej komôrke aspoň 20 min. pri laboratórnej teplote.
  6. Opláchnite opatrne s PBS.
  7. Umiestnite preparát do premývacej nádoby s PBS na 5 min
  8. Prejdite na bod: príprava substrátu a vizualizácia.


Variant 2 – detekcia enzýmovo značenou  sekundárnou protilátkou

  1. Odstráňte prebytočnú kvapalinu (napr. trepaním) a opatrne otrite okolo rezu.
  2. Narieďte sekundárnu protilátku značenú peroxidázou alebo alkalickou fosfatázou zrieďovacím roztokom na optimálnu koncentráciu.
  3. Aplikujte 100 μl na každý preparát; pokryte rez.
  4. Naklonením sklíčka  v rôznych smeroch rozmiestnite roztok  rovnomerne po preparáte.  
  5. Inkubujte 30 min. pri laboratórnej teplote alebo pri  37 °C vo vlhkej komôrke.
  6. Opláchnite opatrne s PBS.
  7. Umiestnite preparát do premývacej nádoby s PBS na 5 min.


Príprava substrátu

Pripraviť substrát sa doporučuje počas posledného premývacieho kroku.
Poznámka: prídavok 1 mM levamisolu (katalóg. číslo L9756) k substrátovemu roztoku pre alkalickú fosfatázu inhibuje z veľkej časti endogénnu aktivitu alkalickej fosfatázy (až na črevné izoenzýmy).

Vyvíjanie

  1. Odstráňte prebytočnú kvapalinu (napr. trepaním) a opatrne otrite okolie rezu.
  2. Aplikujte dostatok kvapiek čerstvo pripraveného substrátoveho roztoku tak, aby bol prekrytý tkanivový rez. 
  3. Inkubujte 5-10 min. alebo až je požadovaná farebná reakcia pozorovateľná mikroskopom. Ukončite reakciu pred tým, ako sa začne zafarbovať pozadie v negatívnej kontrole opatrným opláchnutím destilovanou vodou. 


Dofarbovanie
Poznámka: pri použití AEC substrátu, nepoužívať roztok obsahujúci alkohol pre dofarbovanie (napr. Harris' hematoxylin, acid alcohol), pretože zafarbenie vzniknuté pomocou AEC je rozpustné v organických rozpúšťadlách. Preparát nesmie byť dehydratovaný, prenesený späť do toluénu (xylénu) alebo montovyný pomocou činidiel obsahujúcich toluén.

  1. Aplikujte dostatočné množstvo hematoxylínu na pokrytie rezu alebo vložte preparát do nádoby s hematoxylínom (Mayer's hematoxylín).
  2. Inkubujte 0,5-5 min. v závislosti na potrebnom zosilnení zafarbenia.
  3. Opláchnite preparát opatrne destilovanou vodou.
  4. Opláchnite preparát zľahka pod tečúcou vodou po dobu 5 min. (vyhnite sa  priamemu prúdu, ktorý môže „vymyť“ alebo „uvoľniť“ rez).
  5. Zamontujte rez pomocou vodných činidiel ako napríklad  glycerolovým gélom.  Krycie sklíčko môže byť utesnené  priehľadným lakom.


Referencie

  1. Cuello, A.C. (Ed.), Immunohistochemistry II, Wiley Press, NY (1993) (Product Code I4018).