Attention:

Certain features of Sigma-Aldrich.com will be down for maintenance the evening of Friday August 18th starting at 8:00 pm CDT until Saturday August 19th at 12:01 pm CDT.   Please note that you still have telephone and email access to our local offices. We apologize for any inconvenience.

Slovensko

Imunoprecipitácia

Imunoprecipitácia (IP) je jedna z najčastejšie používaných imunochemických metód. Používa sa bežne spolu s nasledovnými SDS-PAGE a imunoblottingom v rôznych aplikáciach, ako napr.: stanovenie molekulovej hmotnosti bielkovín, stanovenie špecifickej enzýmovej aktivity, monitorovanie bielkovín po translačných modifikáciach a stanovenie ich prítomnosti a množstva. IP technika rovnako umožňuje detekciu zriedkavo sa vyskytujúcich bielkovín, pretože imunoprecipitáciou dochádza k ich zakoncentrovaní (až 10 000x).

Pri imunoprecipitácii je bielkovina z bunky alebo tkanivového homogenátu precipitovaná vo vhodnom lyzovacom pufri pomocou imunokomplexu, ktorý zahŕňa antigén, primárnu protilátku a Proteín A-, G-, L- agarózový konjugát alebo konjugát sekundárna protilátka - agaróza. Výber agarózového konjugátu závisí na živočíšnom druhu, pôvode a izotype primárnej protilátky. Popisované metódy sú porovnateľné a výber metódy špecificky závisí na systéme antigén - protilátka.


Reagencie a zariadenie


  1. Agarózové konjugáty: napr. Proteín A imobilizovaný na Sepharose® CL-4B (katalóg. číslo  P3391) alebo Proteín G-Agarose 4B (katalóg. číslo P3296) alebo Proteín L-Agarose (katalóg. číslo P3351) alebo protilátka – agaróza konjugát (sekundárna protilátka konjugovaná podľa živočíšneho druhu - pôvodu a izotypu primárnej protilátky).
  2. Bunkový alebo tkanivový lyzát.
  3. Primárna protilátka na imunoprecipitáciu (vzťahujúca sa k špecificite produktu) a nerelevantná protilátka (ako negatívna kontrola).
  4. SDS-PAGE a reagencie a zariadenie pre imunoblotting.
  5. HNTG pufer: 20 mM HEPES pufer pH 7.5 (katalóg. číslo H4034), obsahujúci 150 mM NaCl (katalóg. číslo S9625), 0.1% (w/v) Triton X-100 (katalóg. číslo X-100) a10% (w/v) glycerol (katalóg. číslo G9012).
  6. Premývací pufer (ľadový): HNTG pufer alebo PBS pH 7.4 (katalóg. čísloP4417) alebo iné pufre (RIPA pufer), podľa stupňa požadovaného premývania.
  7. Laemmli vzorkový pufer (ako napr. 1x, 2x - katalóg. číslo S3401 alebo 3x ) obsahujúci2-merkaptoetanol (katalóg. číslo M7154) alebo bez tejto látky.
  8. Mikrocentrifugačné  skúmavky , Eppendorf (katalóg. číslo T9661).
  9. Mikrocentrifúga a orbitálna trepačka alebo trepačka s kývavým pohybom.

 


Postup


Imunoprecipitácia (IP) špecifických antigénov
Poznámka: Všetky IP kroky sa uskutočňujú za použitia mikrocentrifugačných skúmaviek na ľade, pokiaľ nie je uvedené inak. 
Ak sú  agarózové konjugáty  v práškovej forme, resuspendujú sa v  deionizovanej vode namočením na 5 minút, resp. podľa priloženého pracovného návodu. 

  1. Premyte agarózové konjugáty dvakrát premývacim pufrom, Centrifugujte 10 s pri 12,000 x g pri laboratórnej teplote. Odstráňte supernatant.
  2. Resuspendujte agarózové  konjugáty v premývacom pufri (50% suspenzie).
  3. Pokračujte podľa potreby metódou A alebo B.

     

Metóda A

  1. Rozpipetujte suspenziu agarózového konjugátu  po 50-100 µl (približne 25-50 µl  agarózy/celkový objem suspenzie) do mikrocentrifugačných skúmaviek.
  2. Pridajte do každej skúmavky 10 µl primárnej protilátky vhodne nariedenej (príslušná protilátka so zodpovedajúcou špecificitou).
  3. Inkubujte 15-60 min. pri laboratórnej teplote, vzorky mierne miešajte na vhodnej trepačke.
  4. Centrifugujte pri 3,000 x g  2 min. pri  4 °C. Odstráňte supernatant.
  5. Premyte každú vzorku 1 ml premývacieho pufru, centrifugujte pri 3,000 x g 2 min. pri 4 °C. Opakujte tento krok najmenej dvakrát.
  6.  Pridajte ku každej vzorke  0.1-1.0 ml bunkového lyzátu.
  7. Inkubujte 90 min., event. cez noc pri 4 °C, mierne vzorky miešajte na vhodnej trepačke.
  8. Peletujte precipitované imunokomplexy  odstredením pri 3,000 x g po dobu 2 min. pri 4 °C. Odstráňte supernatant.
  9. Resuspendujte pelety v 1 ml premývacieho pufru, centrifugujte pri 3,000 x g 2 min. pri 4 °C. Opakujte tento krok najmenej trikrát.

     


Metóda B

  1. 4. Pridajte k vzorkám  bunkového lyzátu (0.1-1.0 µl) 10 µl vhodne nariedenej primárnej protilátky (príslušná protilátka so zodpovedajúcou špecificitou).
  2. Inkubujte 90 min., event. cez noc pri  4 °C, mierne vzorky miešajte na vhodnej trepačke.
  3.  Pridajte 50-100 µl suspenzie agarózového konjugátu  (približne 25-50 µl agarózy/celkový objem suspenzie).
  4. Inkubujte 15-60 min. pri 4 °C, mierne vzorky miešajte na vhodnej trepačke.
  5. Peletujte precipitované imunokomplexy odstredením pri 3,000 x g po dobu 2 min. pri 4 °C. Odstráňte supernatant.
  6. Resuspendujte pelety v 1 ml premývacieho pufru, centrifugujte pri 3,000 x g po dobu 2 min. pri 4 °C. Opakujte tento krok najmenej trikrát.


Príprava na SDS-PAGE


  1. Resuspendujte každý pelet v 25-100 µl vzorkového pufru (Laemmli)  na konečnú koncentráciu vzorkového pufru – 1x  riedenie ( 1:1 so vzorkovým pufrom). Zahrievajte vzorky  pri 95 °C po dobu 5 min.
  2. Centrifugujte 30 s pri 12,000 x g pri laboratórnej teplote. Odoberte takto  získaný supernatant  (IP vzorka). Supernatant, ak je to potrebné, môžete skladovať pri -70 °C.
  3. Naneste vzorky a  štandardy molekulovej hmotnosti so známou koncentráciou na SDS-PAGE (vhodná koncentrácia polyakrylamidového gélu sa riadi podľa veľkosti proteínov).
  4. Uskutočnite transfer na blotovaciu membránu a následne urobte imunoblotting (pozri  Imunoblotting, pracovný postup).

     


Literatúra:


  1.  Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Laboratory Press (New York, 1988), p. 469. (Product Code A2926)