Slovensko

Nepriama ELISA

Reagencie a zariadenia

  1. Fosfátový fyziologický roztok , PBS (tablety): 10 mM fosfátový pufer, pH 7.4, 150 mM NaCl (katalóg. číslo P4417) a 0.1% azid sodný (katalóg. číslo S2002).
  2. Hydrogénuhličitanový pufer, pH 9.6 (katalóg. číslo C3041).
  3. Premývací pufer (PBS-T): 10 mM fosfátový pufer pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (katalóg. číslo P3563).
  4. Monoklonálna primárna protilátka.
  5. Negatívna kontrola: nešpecifické imunoglobulíny rovnakého živočíšneho druhu aizotypu (napr. myšacie myelómové bielkoviny ako kontrolapre myšaciu
    monoklonálnu primárnu protilátku).
  6. Sekundárna protilátka značená alkalickou fosfatázou alebo peroxidázou.
  7. Substrát pre konjugáty s alkalickou fosfatázou (ako napr. SIGMA FAST™ pNPP tablety, katalóg. číslo N1891) alebo pre peroxidázové konjugáty (ako napr. SIGMA FAST™ OPD tablety, katalóg. číslo P9187).
  8. Roztok na zastavenie reakcie pre alkalickú fosfatázu: napr. 3 M NaOH alebo pre peroxidázu : 3 M HCl alebo 3 M H2SO4.
  9. Mikrotitračné doštičky (katalóg. číslo M0156)
  10. Fotometer (filtre : 405 nm alebo 450/492 nm , pre pNPP resp. OPD).


POSTUP

Viazanie (coating) antigénu

  1. Pripravte väzobný roztok antigénu vhodnej koncentrácie vhydrogenuhličitanovom pufri alebo PBS.
  2. Napipetujte 0.2 ml väzbového roztoku antigénu do každej jamky mikrotitračnej doštičky.
  3. Inkubujte pri 37 °C 30 min. alebo cez noc pri 4 °C.
  4. Odstráňte väzbový roztok. Premyte opakovane s PBS-T (3x). Poznámka: Pri probléme snešpecifickou väzbou sa môže pridať ešte jeden krok: 30 min. 5% BSA-PBS (event. dalšie informácie : Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).

Primárna protilátka (Reakcia)


  1. Narieďte monoklonálnu primárnu protilátku v PBS-T. Stanovte optimálne riedenie titráciou.
  2. Pridajte 0.2 ml nariedenej primárnej protilátky do každej jamky (okrem jamiek snegatívnou kontrolou). Negatívnú kontrolu narieďte v PBS-T.
  3. Inkubujte pri laboratórnej teplote 2 hodiny.
  4. Odstráňte roztok z jamiek. Premyte opakovane s PBS-T ( 3x).

Aplikácia sekundárnej protilátky

  1. Narieďte konjugovanú sekundárnú protilátku vPBS-T a pridajte 0.2 ml tohto roztoku do každej jamky. Stanovte optimálne riedenie titráciou.
  2. Inkubujte pri laboratórnej teplote 2 hodiny.
  3. Odstráňte roztok z jamiek. Premyte opakovane s PBS-T ( 3x).

 

Príprava substrátu

  1. Počas poslednej inkubácie (pred použitím), pripravte enzýmový substrát alebo preneste predpripravený tekutý substrát navytemperovanie na laboratórnu teplotu.

Vyvíjanie

  1. Pridajte 0.2 ml čerstvo pripraveného substrátu do každej jamky.
  2. Vyvíjanie farebnej reakcie vpozitívnych jamkách po 30 minútach (žltá alebo oranžová, pre pNPP, resp. OPD).
  3. Absorbancia sa meria fotometrom pre mikrotitračné platničky ihneď (pri 405 nm alebo 450 nm, pre pNPP, resp.OPD) alebo sa reakcia zastaví pridaním 50 µl príslušného roztoku (kyseliny alebo zásady) do každej jamky a meria sa neskôr (pri 405 nm alebo 492 nm, pre pNPP resp. OPD).

 

Capture ELISA

Capture ELISA (sendvičová ELISA) je citlivá metóda pre kvantifikáciu substancií (ako sú napr. hormóny, produkty „cell signaling“, antigénov infekčných ochorení, cytokínov atď.) v množstvách od pikogramov po mikrogramy. Použitie tohoto typu metódy ELISA môže byť zviacerých dôvodov výhodnejší ako priama alebo nepriama ELISA. Riedenie analyzovanej látky môže byť napr. príliš vysoké na väzbu na polystyrénovú mikrotitračnú platničku (napr. bielkovina vsupernatante bunkovej kultúry) alebo sa dobre neviaže na plast (napr. malé organické molekuly). Taktiež môže byť v zmesi smnohými inými látkami, ktoré sa dobre viažu na platničku.
Kdispozícii sú napr. dva Sigma kity, s aplikáciou metódy capture ELISA : TNF-alpha kit (katalog. číslo CKH200A) a the Mouse Isotyping Reagents kit (katalóg. číslo ISO-2).

Reagencie a zariadenia

  1. Fosfátový fyziologický roztok PBS, (tablety): 10 mM fosfátový roztok, pH 7.4, 150 mM NaCl (katalóg. číslo P4417) a 0.1% azid sodný (katalóg. číslo S2002).
  2. Hydrogénuhličitanový pufer, pH 9.6 (katalóg. číslo C3041).
  3. Premývací pufer (PBS-T): 10 mM fosfátový pufer pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (katalóg. číslo P3563).
  4. Väzbová protilátka.
  5. Kontrolný antigén pre štandardnú krivku.
  6. Značená detekčná protilátka.
  7. Substrát ako napr. TMB alebo OPD pri použití peroxidázy.
  8. Roztok na zastavenie reakcie.
  9. Mikrotitračné platničky (katalóg. číslo M0156)
  10. Fotometer.

Postup

Poznámka: Tento postup je všeobecný protokol. Optimálne riedenie väzbovej protilátky, vzorky, kontrol, detekčných protilátok a inkubačného času je nutné stanoviť empiricky a môže vyžadovať mnoho titračných experimentov. Vhodné je použiť enzýmovo značenú detekčnú protilátku tak, ako je uvedené vtomto protokole. Avšak ak je detekčná protilátka neznačená, sekundárna protilátka nesmie krížovo reagovať s naviazanou protilátkou alebo vzorkou. Je nutné použiť negatívnu, resp. pozitívnu kontrolu.


Naväzovanie (coating) capture protilátky

  1. Vhodne narieďte väzbovú protilátku vhydrogenuhličitanovom pufri alebo PBS.Typická koncentrácia capture protilátky pre naväzovanie je v rozmedzí 0.2 do 10 mikrogramov/ml. Prednostne je vhodné použiť afinitne čistené protilátky ako IgG frakcie.
  2. Napipetujte 0.2 ml vhodne nariedenej capture protilátky do každej jamky mikrotitračnej platničky.
  3. Inkubujte (zakryté) pri 37 °C 1 hodinu.
  4. Odstráňte väzbový roztok . Premyte opakovane s PBS-T ( 3x).


Aplikácia kontroly vzoriek

  1. Pridajte 0,2 ml roztoku vzoriek a kontrol do každej jamky. Vzorky sa riedia v PBS vrozmedzí koncentrácií 10 nanogramov -10 mikrogramov/jamku (čím je vyššia citlivosť testu, tým menej vzorky sa požaduje).
  2. Inkubujte pri laboratórnej teplote 1 hodinu.
  3. Odstráňte roztok vzoriek, resp. kontrol. Premyte opakovane s PBS-T (3x).

 

Aplikácia detekčnej protilátky

  1. Narieďte enzýmovo značenú detekčnú protilátku.
  2. Napipetujte 0,2 ml vhodne nariedenej detekčnej protilátky do každej jamky.
  3. Inkubujte pri laboratórnej teplote 30 minút .
  4. Odstráňte roztok detekčnej protilátky. Premyte opakovane s PBS-T (3x).
  5. Pridajte vhodný roztok substrátu.
  6. Nechajte vyvíjať asi 30 minút. Pridajte roztok na zastavenie reakcie.
  7. Odčítajte absorbanciu pri zodpovedajúcej vlnovej dĺžke na fotometri pre mikrotitračné platničky.

 

Literatúra

  1. Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (New York,1988), p. 579 (Product Code A2926)
  2. Coligan, J.E. et al. (Eds), Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, (New York, 1991), 2.1.10.
  3. Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, Volume 42: ELISA, Theory and Practice, Humana Press, (New Jersey, 1995) (Product Code Z364150)
  4. Desphande, S.S., Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development, Chapman & Hall, (New York, 1996) (Product Code Z370258)
  5. Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K. (Eds.), Immunoassay, Academic Press, (New York, 1996) (Product Code Z373672)
  6. Ferencik, M., Handbook of Immunochemistry, Chapman & Hall, (New York, 1993), p. 346-356 (Product Code Z370207)
    P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, Elsevier Science Publishers, (Amsterdam, The Netherlands, 1985) (Product Code P6275)