Slovensko

Purifikácia protilátok

V protokole popisujeme rýchlu metódu purifikácie protilátok zo séra cicavcov, ascitu a supernatantu bunkových kultúr. Dôležité je uvedomiť si, že v prípade séra alebo ascitu bude konečný produkt obsahovať iné endogénne IgG, rovnaké ako špecifické protilátky. Vo všeobecnosti by tieto endogénne IgG nemali interferovať s použitou metódou. Obsah imunoglobulínu v sére niektorých živočíšnych druhov je uvedený v tabuľke.
Poznámka: Sigma ponúka kit Pure-1A na purifikáciu protilátok použitím proteínu A.
Protokol: (pre 1 ml kolónu)
Poznámka: V protokole je použitý nanášací pufer pre proteín A s vysokou molaritou a vysokým pH, aby sa dosiahlo zvýšenie väzby podtried Ig so slabo afinitným proteínom A (ako je myší IgG1). Väzba na proteín G a L prebieha v neutrálnom pH, takže ako nanášací pufer je použitý PBS. Elúcia naviazaných Ig je ukončená pridaním citrátového pufru (pH 3), ktorý odstráni všetký podtriedy Ig naviazané na nosiči. Stanovenie väzobnej kapacity proteínu A a proteínu G pre IgG z odlišných druhov môče uľahčiť táto tabuľka. IgG podtriedy označené + alebo ++ budú viazané v pomere 1-5 mg IgG na 1 ml živice. Podtrieda označená +++ alebo ++++ je viazaná v pomere 10-25 mg na 1 ml živice. Proteín L má schopnosť viazania všetkých Ig tried. Druhy označené ++++ sú schopné viazať Ig v pomere 3-10 mg na 1 ml živice.

Reagencie a vybavenie

  1. Sérum, ascites alebo supernatant z bunkových kultúr
  2. Proteín A nanášací pufor: 1 M fosforečnan draselný, pH 9.0
  3. Proteín G alebo L nanášací pufer: 0.01M PBS, pH 7.4 (katalóg. číslo P4417)
  4. Elučný pufer: 0.1 M kyselina citrónová, pH 3.0
  5. 1.5 M Tris na neutralizáciu eluantu
  6. 3 - 5 ml striekačka, sklená vata
  7. Chromatografická kolóna s uzatvárateľnou výpusťou (cca 10 ml)
  8. Spektrometer, kyvety
  9. pH meter
  10. Pipety, skúmavky
  11. Kadičky, miešadlá (na prípravu pufru)
  12. Sterilná filtračná jednotka (nie je nutná) (katalóg. číslo F9643, 200 ml, F9893, 500 ml, nebo F1145, 1000 ml)
  13. Azid sodný (konzervant) (katalóg. číslo S2002)

Metóda

  1. Príprava pufru. Pufer môže byť skladovaný pri  4 °C 1-2 týždne. Sterilná filtrácia predĺži životnosť pufru.
  2. Agarózu resuspendujte v 2 ml nanášacieho pufru. Vyvarujte sa dlhého miešania, nepoužívajte vortex.
  3. Zmes nalejte do kolóny. Prebytočný pufor nechajte prekvapkať, potom kolónu premyte 5 ml nanášacieho pufru. Dajte pozor, aby agaróza úplne nevyschla.
  4. Ak je to možné, stanovte množstvo Ig v sére, ascite alebo supernatante, ktorý má byť nanášaný. Ak neviete, aké je množstvo Ig, tabuľka obsahuje približné hladiny Ig v sére rôzných druhov, v ascite myší a v supernatante bunkových kultúr. Tieto hodnoty môžu byť použité na stanovenie množstva Ig v počiatočnom materiále. Podľa schopností nosiča viazať Ig z rôzných druhov vstupných materiálov a podľa množstva Ig vo vzorkách, vypočítajte objem, ktorý má byť nanesený do kolóny.

    Poznámka: Toto sú približné hodnoty, ktoré môžu pomôcť ako vodítko. Skutočné koncentrácie v tekutinách a väzobná schopnosť na živice sú variabilné a optimálny pomer počiatočného materiálu k živici musí byť stanovený experimentálne.

  1. Narieďte sérum alebo ascites tromi objemami nanášacieho pufru, supernatant narieďte jedným objemom nanášacieho pufru.
  2. Aplikujte nariedený materiál do kolóny. Uschovajte nenaviazané frakcie. Kolónu premyte 5 ml nanášacieho pufru na 1 ml nosiča.
  3. Aplikujte elučný pufer do kolóny.  Zachytávajte frakcie o objeme ½ kolóny. Použite 10 ml elučného pufru na 1 ml nosiča.
  4. Ekvilibrujte kolónu 5 ml nanášacieho pufru na 1 ml živice. Skontrolujte pH eluentu, aby ste sa uistili, že kolóna je ekvilibrovaná na pH nanášacího pufru.
  5. Kvantifikujte množstvo proteínu vo frakciách eluentu pri absorbancii 280 nm. (V prípade potreby môže byť stanovené opticky použitím Total Protein Kit [katalógové číslo 610-A]).
  6. Spojte frakcie, ktoré sú pozitívne na proteíny. Neutralizujte na pH 6 - 8 použitím 1.5 M Tris.
  7. Pokiaľ množstvo nanesenej vzorky presiahlo kapacitu kolóny, je možné, že niektoré Ig neboli v prvom kroku naviazané. Táto frakcia môže byť opätovne aplikovaná do kolóny na izoláciu Ig.
  8. Dialyzujte v pufri, napr.  PBS, pH 7, pri 4 °C. Objem dialyzačného pufru by mal byť najmenej 20krát väčší ako je objem proteínového roztoku. Najmenej dve výmeny dialyzačného pufru, každá najmenej po dobu 2-4 hodín, aby bola zabezpečená kompletná ekvilibrácia v dialyzačnom pufri.
  9. Ak už nenasleduje ďalší krok, premyte kolónu s PBS, obsahujúci 0.05 - 0.1% azidu sodného. Utesnite kolónu zátkou alebo Parafilmom a skladujte pri 4 °C.

Poznámka: Ak je vyžadovaná separácia myších a ľudských IgG izotypov je možné použiť gradient formujúci prístroj (napr. katalogové číslo G6897) k vytvorení lineárneho pH gradientu v  0.1 M citrátovom pufri  od pH 6.5 do pH 3.0. Celkový objem gradientu by mal byť najmenej 10 krát väčší ako objem kolóny. Dochádza k rozdeleniu eluátu do viacerých frakcií, každá musí byť neutralizovaná a testovaná. Výsledný produkt je výťažkom niekoľkých píkov, každý musí byť neutralizovaný a  testovaný, výsledný produkt je viac zriedený než pri jednokrokovéj elúcii.