Estrategias de fabricación de vacunas y tratamientos basados en ARNm

Gracias a la rapidez con la que se pasa del desarrollo a la fase clínica, la tecnología del ARNm resulta prometedora, no solo como agente rápido y eficaz para responder a brotes de enfermedades infecciosas, sino también para el desarrollo de nuevas terapias destinadas a tratar enfermedades con necesidades médicas no cubiertas. Las tecnologías del ARNm ofrecen múltiples ventajas: un excelente perfil de seguridad, un alto grado de versatilidad y un proceso de fabricación basado en plantillas.

Tras el éxito inicial de las vacunas de ARNm, los fabricantes actuales de ARNm buscan mejorar la eficiencia y la productividad de sus procesos de producción mediante la mejora de la estabilidad del ARNm y la implementación de estrategias que mejoren la purificación del ADNp y del ARNm y permitan escalar a la producción conforme a las buenas prácticas de fabricación (GMP).

Vea todos nuestros productos y servicios para el desarrollo y la fabricación de ARNm.

Descripción general de la sección

• Consideraciones para la fabricación de ARNm
• Fabricación de ARNm
• Purificación del ARNm
• Consideraciones para la ampliación de escala

Consideraciones sobre la fabricación de ARNm

La fabricación de vacunas y terapias de ARNm suele seguir un proceso basado en plantillas (Figura 1). Esta plantilla de fabricación simplificada utiliza los mismos materiales de reacción para cualquier diana y permite a los fabricantes de ARNm producir nuevas moléculas diana con adaptaciones mínimas del proceso.

Figura 1. Descripción general del proceso de fabricación de ARNm.

Hay varias decisiones clave que tienen un impacto considerable en el proceso, el rendimiento y la calidad del producto final de ARNm, y una de ellas es la calidad de los productos químicos y las materias primas utilizados en el proceso. Especialmente durante la transcripción in vitro y la purificación posterior, el ARNm se encuentra desprotegido y expuesto a un alto riesgo de degradación enzimática. El uso de productos químicos de alta calidad, sometidos a pruebas para garantizar la ausencia de actividad endonucleásica, minimiza el riesgo de degradación inducida por RNasa y mejora la estabilidad del ARNm a lo largo de todo el proceso de purificación y formulación del medicamento de ARNm.

Esta página web le ayudará a afrontar estos y otros retos, proporcionándole información sobre nuestras soluciones integrales y completas, diseñadas para optimizar su fabricación de ARNm. Nuestro folleto «Productos químicos de proceso para la fabricación de medicamentos de ARNm» ofrece los detalles que necesita para tomar decisiones informadas.

ARNm: elementos estructurales y sus funciones

La construcción del ARNm está diseñada para garantizar la expresión eficiente del gen de interés. La estabilidad, la expresión génica y la traducción eficiente de proteínas dependen de varios elementos estructurales (Figura 2):

Figura 2. Estructura del ARNm.

• Región de la caperuza en el extremo 5’ de la secuencia: esencial para la maduración del ARNm, el reconocimiento por parte del ribosoma para una traducción proteica eficiente y la protección frente a la digestión por nucleasas, lo que mejora su estabilidad.
• Regiones no traducidas (UTR) en los dominios aguas arriba y aguas abajo de la región codificante del ARNm: regulan la traducción, la localización y la estabilidad del ARNm; pueden utilizarse para mejorar la eficiencia de la expresión proteica.
• Marco de lectura abierto o región de secuencia codificante: contiene el gen de interés (GOI).
• Cola poli(A): crucial para la traducción de proteínas y la estabilidad del ARNm, ya que impide la digestión por la exonucleasa 3’.

Fabricación de ARNm

La producción de terapias y vacunas basadas en ARNm comienza con una molde de ADN plasmídico (pDNA) que posteriormente se linealiza y se transcribe en ARNm.

• Producción de pDNA: La plantilla de pDNA contiene un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN y la secuencia para el constructo de ARNm. El pDNA se amplifica en células bacterianas, que posteriormente se recogen y se lisan para liberar el pDNA circular. Este lisado es extremadamente viscoso, ya que contiene el pDNA y otras impurezas de gran tamaño y carga negativa, como ARN, ADN genómico y endotoxinas de las células bacterianas, lo que dificulta la purificación.
• Purificación del pDNA: La purificación de la molde de pDNA de impurezas debe maximizar la separación y minimizar el riesgo de daño mecánico a la molde del plásmido. A continuación, el pDNA circular purificado se linealiza para evitar eventos de lectura transcripcional que puedan generar variantes de secuencia de ARNm no deseadas que habría que eliminar.¹ Esta molde de pDNA linealizada se purifica aún más para eliminar impurezas como la enzima de restricción utilizada para la linealización, la albúmina sérica bovina (BSA), fragmentos de ADN y endotoxinas. Dado que la molde de ADNp se produce normalmente en células bacterianas, las impurezas de endotoxinas son un factor crítico que afecta a las etapas de purificación posteriores. Se pueden utilizar detergentes como el Deviron^® C16 para eliminar eficazmente las endotoxinas, y constituyen una alternativa sostenible, biodegradable y conforme al reglamento REACH frente a los detergentes tradicionales.²

Existen diferencias notables en el enfoque de la purificación del pDNA a escala de laboratorio y a escala de producción GMP. Los procesos a escala de laboratorio suelen utilizar técnicas de extracción con disolventes para separar el pDNA de otros componentes, pero la manipulación y la eliminación de estos productos químicos a gran escala pueden suponer un reto. Por el contrario, los entornos de producción GMP suelen utilizar la filtración de flujo tangencial (TFF) y la cromatografía para la eliminación eficaz de impurezas. 

Transcripción in vitro (IVT): El ADN purificado y linealizado se transcribe a ARNm mediante una reacción enzimática.

• Entre los componentes críticos para la transcripción in vitro se incluyen la ARN polimerasa, que cataliza la transcripción del ADN en ARNm; los ribonucleósidos trifosfatos (rNTP), que sirven como bloques de construcción del ARNm; la pirofosfatasa inorgánica (IPP), que mejora el rendimiento del ARNm; y los inhibidores de la RNasa, que previenen la degradación del ARN. El tampón de transcripción suele contener ditiotreitol (DTT) para reducir los enlaces disulfuro e inhibir la actividad de la RNasa, mientras que se incluye espermidina para mejorar la eficiencia de la transcripción y estabilizar los ácidos nucleicos. Para minimizar el riesgo de degradación enzimática en este paso crítico del proceso, es esencial seleccionar productos químicos que hayan sido sometidos a pruebas para descartar la presencia de actividad endonucleasa. Para obtener una visión general completa de nuestros productos químicos y excipientes de alta calidad, incluida una amplia gama de productos libres de endonucleasas, consulte nuestro folleto «Productos químicos de proceso para la fabricación de fármacos de ARNm».
• Monitorización de la transcripción: Los parámetros críticos del proceso (CPP) deben monitorizarse durante la reacción IVT para controlar los atributos críticos de calidad (CQA) y garantizar un procesamiento óptimo. Una monitorización eficaz permite una fabricación más controlada y respuestas más rápidas a la variabilidad del proceso. 

Capuchón: Tras la transcripción, se añade una estructura de capuchón 5’ al transcrito de ARNm para mejorar la estabilidad y la transducción en la célula huésped. El capuchón puede añadirse de dos maneras:

• Capuchón co-transcripcional: se realiza durante la etapa de IVT. Sin embargo, la eficiencia y el rendimiento son bajos, y este enfoque puede generar impurezas sin capuchón debido a una unión incorrecta o a una incorporación inversa.
• El capado enzimático (o capado postraduccional) se realiza tras la purificación del ARNm. Este enfoque suele utilizar una enzima de capado para añadir el cap al ARNm purificado. Aunque este enfoque es más eficiente, resulta más costoso y supone un paso de procesamiento adicional tras la purificación.

Purificación del ARNm

Tras la transcripción in vitro, el ARNm se purifica de las impurezas y los materiales utilizados en los pasos anteriores, incluyendo endotoxinas, ARN bicatenario (ARNbc) inmunogénico, molde de ADN residual, ARN polimerasa e impurezas elementales. Existen varias opciones disponibles para la purificación del ARNm y la eliminación del ADN residual.

La separación cromatográfica, como la cromatografía de pares iónicos en fase inversa (IPRP), la cromatografía de intercambio aniónico (AEX) y la cromatografía de afinidad (AC) mediante captura con poli(dT) (Figura 3), purifica eficazmente el ARNm diana y elimina la molde de ADN, lo que hace innecesaria la digestión del ADN^¹⁻³. La cromatografía también se utiliza tras el capping enzimático para eliminar transcripciones de ARNm no deseadas e impurezas de oligonucleótidos.

Figura 3: Comparación entre la cromatografía de fase inversa con pares iónicos, la cromatografía de intercambio aniónico y la cromatografía de afinidad para la purificación de ARNm (DBC: capacidad de unión dinámica).^4,5

• La cromatografía de emparejamiento iónico en fase inversa (IPRP) puede utilizarse a pequeña escala para capturar de manera eficaz el ARN monocatenario (ssRNA) de interés y separarlo de las impurezas. Sin embargo, dado que este método requiere disolventes, resulta menos adecuado para la fabricación conforme a las buenas prácticas de fabricación (GMP) y es más adecuado para el refinamiento que para la captura.
• La cromatografía de intercambio aniónico (AEX) tiene una alta capacidad de unión dinámica y elimina eficazmente impurezas como el ARN bicatenario (dsRNA), el ARN sin caperuza, los híbridos de ARN-ADN y otras estructuras de ARN, como el ARNm en horquilla. Aunque la AEX utiliza soluciones acuosas, requiere agentes caotrópicos potencialmente tóxicos y temperaturas de funcionamiento de hasta 85 °C para desorber las grandes moléculas de ARNm unidas a la resina.
• La cromatografía de afinidad (AC) con captura de poli(dT) utiliza una resina para capturar específicamente la cola poli(A) de las transcripciones de ARNm de longitud completa. Este método elimina eficazmente el ADN, los nucleótidos, las enzimas, los componentes del tampón y cualquier otra impureza que no tenga una cola poli(A). Por este motivo, la AC se utiliza habitualmente para la captura inicial de ARNm, seguida de la AEX para el pulido.
• La concentración final y la diafiltración se realizan tras los pasos de cromatografía para maximizar la pureza del producto y transferir el ARNm al tampón adecuado para su formulación o almacenamiento.

Consideraciones sobre la ampliación de escala

Las tecnologías de un solo uso ofrecen escalabilidad, adaptabilidad y calidad a los fabricantes con una amplia cartera de objetivos y son un factor clave en muchos procesos de fabricación de ARNm conforme a las buenas prácticas de fabricación (GMP). La fabricación conforme a las GMP aprovecha las ventajas de los pasos de TFF o cromatografía para una separación eficiente a gran escala, sustituyendo los métodos de purificación alternativos típicos del desarrollo de procesos a pequeña escala. Entre las consideraciones a tener en cuenta se incluyen:

• Los pasos de TFF o cromatografía sustituyen a los pasos de extracción con disolventes y precipitación que se utilizan con frecuencia en el desarrollo de procesos de ARNm.
• Siempre que sea posible, deben utilizarse productos químicos de alta calidad y reactivos libres de endonucleasas para mejorar la estabilidad del ARNm y minimizar la posibilidad de su degradación.

En los últimos años se han logrado grandes éxitos en el despliegue de vacunas de ARNm para grandes poblaciones de pacientes. Aunque siguen existiendo retos, el enfoque en maximizar la estabilidad del ARNm mediante el uso de productos químicos de alta calidad y reactivos libres de endonucleasas, así como la optimización y adaptación de las tecnologías de purificación cromatográfica para maximizar la separación y agilizar la ampliación de escala, ha dado lugar a importantes avances en los modelos de fabricación conforme a las buenas prácticas de fabricación (GMP).  

Para garantizar que la tecnología del ARNm alcance todo su potencial, se necesitarán soluciones innovadoras, experiencia y creatividad a fin de asegurar el desarrollo de plataformas sólidas a escala de producción. Con nuestros productos, servicios y experiencia técnica, nos comprometemos a desarrollar soluciones integradas para optimizar su proceso de fabricación de ARNm.

Referencias

1. Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Patent No. WO2014152031A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152031A1/en

2. Kiesewetter A, Gupta A, Heinen‐Kreuzig A, Greenhalgh T, Stein A. 2023. Improved endotoxin removal using ecofriendly detergents for intensified plasmid capture. Biotechnology Progress. 39(6): https://doi.org/10.1002/btpr.3375

3. Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en

4. Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en

5. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3