Protokolle & Einführung für die Nukleinsäuren-Elektrophorese
Einführung
Agarose-Gelelektrophorese für DNA
Agarose-Gelelektrophorese für RNA
Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA
Literatur
Einführung – Was ist Elektrophorese?
Elektrophorese ist ein Verfahren zum Trennen und Aufreinigen von Makromolekülen wie Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Proteinen, das auf der Nettoladung, Größe und Konformation auf einer Matrix basiert. Nukleinsäuren haben aufgrund des Vorhandenseins des Phosphatgerüsts eine negative Gesamtladung. Daher bewegen Sie sich mit einer Migrationsgeschwindigkeit, die allein durch ihre Größe bestimmt wird, zur Anode. Proteine haben eine positive oder negative Gesamtladung. Dies ermöglicht die Bewegung eines Proteinmoleküls zu einem pH-Wert, der isoelektrischer Punkt genannt wird. An diesem Punkt weist das Molekül keine Nettoladung auf. Durch die Denaturierung der Proteine und indem ihnen eine gleichmäßige Ladung verliehen wird, ist es möglich, sie basierend auf der Größe zu trennen. Die Makromoleküle werden innerhalb einer Matrix oder eines Gels aus Agarose oder Polyacrylamid elektrophorisiert. Die Gele aus diesen Polymeren enthalten Poren, durch die die Proteine und Nukleinsäure passieren können, wenn eine Spannung angelegt wird.
Agarose-Gelelektrophorese für DNA
Agarose ist ein Polysaccharid, das aus Seetang extrahiert und in der Regel zu Konzentrationen von 0,5–2 % für die Elektrophorese von DNA und RNA eingesetzt wird. Es bildet ein Gitter mit geeigneter Porengröße, das die Bewegung von Nukleinsäuren zu der positiven Elektrode ermöglicht.
Abbildung 1.Agarose-Gelelektrophorese für Nukleinsäuren
Protokoll: Agarose-Gelelektrophorese für DNA
Erforderliche Materialien und Reagenzien
- Elektrophoresekammer mit Energieversorgung, Gießwanne und Kämmen
- Bionic™-Puffer (B6185) oder ein geeigneter Elektrophorese-Laufpuffer:
1 X TAE (65497) enthält:
0,04 mol/l Tris-Acetat (pH-Wert 7,6)
0,001 mol/l EDTA
ODER
1 X TBE (93290) enthält:
0,13 mol/l (pH-Wert 7,6)
45 mmol/l Borsäure
2,5 mmol/l EDTA
- Probenpuffer (G7654, G2526) oder in 1 X TAE oder 1 X TBE mit Folgendem hergestellt:
50 % Glycerin
0,25 % Bromphenolblau (B5525)
0,25 % Xylencyanol FF (X4126)
- BlueView™-Nukleinsäurefärbung (T9060 und T8935), SYBR® Green-Nukleinsäurefärbung (S9430) oder Ethidiumbromid: 0,5 µg/ml, hergestellt in destilliertem Wasser.
- Transilluminator
Vorgegossene Agarosegele
Sigma-Aldrich hat vorgegossene Agarosegele im 8-, 20- und 24-Well-Format mit zugegebenem Ethidiumbromid im Angebot. Fahren Sie mit dem Schritt „Laufenlassen des Gels“ fort, falls vorgegossene Gele verwendet werden.
Alternativ können Sie mit folgendem Verfahren Ihre eigenen Agarosegele gießen.
Herstellen von Agaroselösung
- Messen Sie die geeignete Menge Agarosepulver ab und geben Sie es in einem Becherglas oder Kolben zu 1 X TAE-Puffer.
Hinweis: Die Agarosemenge ist von dem erforderlichen Anteil in dem Gel abhängig. Das Volumen der Agaroselösung muss entsprechend der Größe der verwendeten Gelwanne hergestellt werden. - Lösen Sie die Agarose durch Erwärmen auf einem Heizrührer. Alternativ kann sie in einer Mikrowelle erwärmt werden. Dabei muss sie jede Minute verwirbelt werden, bis die Agarose komplett gelöst ist.
- Wenn die Agarose auf 50–60 °C abgekühlt ist, geben Sie Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,5 µg/ml) zu der Lösung. Eine weitere Alternative ist das Eintauchen des Gels in Ethidiumbromidlösung nach der Elektrophorese.
WICHTIG: Ethidiumbromid ist ein krebserregender Stoff. Tragen Sie stets Handschuhe und eine Maske, wenn Sie mit Ethidiumbromid arbeiten. - Bereiten Sie die Gelwanne für das Gießen des Gels vor, während die Agarose abkühlt, sodass die Agaroselösung nicht ausfließt, bevor sie aushärtet. Dies kann durch Gussdämme, einen Gelgießstand oder Abdichten mit traditionellem Laborklebeband sichergestellt werden. Platzieren Sie den Kamm in den Rillen und die Wanne in einer ebenen horizontalen Position.
- Gießen Sie die Agaroselösung langsam, sodass sie gleichmäßig in der Wanne verteilt wird und keine Luftblasen in dem Gel eingeschlossen werden. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren.
- Entfernen Sie die Kämme und geben Sie das Gel mit der Wanne in den Hauptbehälter, den Sie mit 1 X Elektrophoresepuffer füllen, bis das Gel gerade mit Puffer bedeckt ist.
Aufbereitung von DNA-Proben
Sigma-Aldrich hat GenElute™-Kits zur Isolation von DNA aus Pflanzen und Pilzen (E5038), Säugetierzellen oder -gewebe (G1N70, G1N10 und G1N350) und Blut (NA2010 und NA2020) im Angebot.
Um die isolierte DNA vor der Zersetzung zu schützen wird empfohlen, dass die DNA in TE-Puffer (T9285) gelöst wird.
Außerdem können DNAstable®-Kits (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML und 93121-017-1EA) verwendet werden, falls die DNA geliefert wird oder für die Lagerung und Stabilisierung von DNA bei Raumtemperatur.
- Isolieren Sie die DNA mit dem Standardprotokoll aus Zellen oder Gewebe.
- Die Mindestkonzentration von DNA, die für den Nachweis auf Agarosegel bei einer Färbung mit Ethidiumbromid erforderlich ist, beträgt 2 ng.
- Mischen Sie die Nukleinsäureproben mit 10 X Probenpuffer. Allgemein reichen 3 µl Probenpuffer aus. Für Proben von weniger als 10 µl können jedoch geringere Volumen verwendet werden.
Laufenlassen des Gels
- Laden Sie die Proben vorsichtig mit Pipetten in die Wells. Ein geeigneter Marker, der Nukleinsäurenfragmente verschiedener Größen enthält, kann auch beladen werden (D7058, D3937, D3812).
- Platzieren Sie den Deckel auf dem Behälter und schließen Sie die Energieversorgung an. Eine typische Spannung zum Laufenlassen der Proben in Agarosegelen beträgt 90–150 V.
- Sie sollten die Laufmittelfront mit Orange G (O3756), Bromphenolblau (B8026) oder Xylencyanol (x4126) überwachen.
| Gelkonzentration (% w/v) | Effektiver Trennungsbereich (bp) | Xylencyanol (bp) | Bromphenolblau (bp) |
|---|---|---|---|
| 3,5 | 1.000–2.000 | 460 | 100 |
| 5,0 | 50–500 | 260 | 65 |
| 8,0 | 60–400 | 160 | 45 |
| 12,0 | 40–200 | 70 | 20 |
| 15,0 | 25–150 | 60 | 15 |
| 20,0 | 6–100 | 45 | 12 |
Gelfärbung und Ansicht
Gele mit integriertem Ethidiumbromid:
- Geben Sie das Gel nach der Elektrophorese in einen UV-Transilluminator und erhalten Sie die Abbildung des Gels.
- Die Proben erscheinen als helle Banden.
Gele ohne integriertes Ethidiumbromid:
- Geben Sie das Gel nach der Elektrophorese für 15–30 min in SYBR® Green-Nukleinsäurenfärbung (1:10.000 verdünnt, Färbung im Dunkeln) oder 0,5 µg/ml Ethidiumbromid-Färbelösung.
- Falls eine SYBR® Green-Nukleinsäurenfärbung verwendet wird, kann die Abbildung des Gels direkt nach der Färbung erhalten werden.
- Falls Ethidiumbromid verwendet wird, entfärben Sie das Gel für 10–30 min in destilliertem Wasser. Stellen Sie dabei sicher, dass das Gel vollständig in das Wasser eingetaucht ist.
- Geben Sie das Gel in einen UV-Transilluminator und erhalten Sie die Abbildung des Gels.
- Die Proben erscheinen als helle Banden.
Fluoreszenzfärbung von Agarosegelen
Sigma-Aldrich hat Nancy-520 (01494) im Angebot, eine fluoreszierende Färbung, die anstelle von Ethidiumbromid verwendet werden kann. Sie ist eine sicherere, stabile und umweltfreundlichere Alternative zu Ethidiumbromid. Nancy-520 hat eine Anregungswellenlänge von 520 nm und eine Emissionswellenlänge von 560 nm.
Gele mit integriertem Nancy-520:
- Nancy-520 kann beim Gießen des Gels in die Agarose integriert werden (10 µl bis 50 ml Agarose).
- Erhalten Sie nach dem Durchlauf eine Fluoreszenzabbildung des Gels.
Gele ohne integriertes Nancy-520:
- Stellen Sie Färbelösung her, indem Sie 10 µl Nancy-520 zu 50 ml 1X-TBE-Puffer geben.
- Tauchen Sie das Gel nach der Elektrophorese für 1 h im Dunkeln auf einem Schütteltisch in die Färbelösung.
- Spülen Sie das Gel 10–30 Sekunden lang mit 1 X TBE-Puffer.
- Machen Sie ein Fluoreszenzbild des Gels.
Abbildung 2.Horizontales Elektrophoresesystem
Agarose-Gelelektrophorese für RNA
Die Qualität der RNA kann durch Agarose-Gelelektrophorese bewertet werden, die die RNA basierend auf ihrer Größe und Intaktheit trennt. Aufgrund von umfangreicher intramolekularer Basenpaarung, die die größenbasierte Migration auf dem Agarosegel stört, bildet die RNA jedoch verschiedene Sekundärstrukturen. Deshalb müssen die RNA-Moleküle mit Formamid und Formaldehyd denaturiert werden.
Protokoll: Agarose-Gelelektrophorese für RNA
Erforderliche Materialien und Reagenzien
Stellen Sie sicher, dass die verwendete Ausrüstung RNase-frei ist und alle verwendeten Puffer in RNase-freiem Wasser hergestellt werden.
- Elektrophoresekammer mit Energieversorgung, Gießwanne und Kämmen
- 1 X MOPS-EDTA-Natriumacetat (MESA)-Puffer (M5755):
40 mmol/l MOPS
10 mmol/l Natriumacetat
1 mmol/l EDTA (pH-Wert 8,3)
- RNA-Probenpuffer (R1386 und R4268)
62,5 % (v/v) entionisiertes Formamid
1,14 mol/l Formaldehyd
1,25 X MESA-Puffer
200 µg/ml Bromphenolblau (B2225)
200 µg/ml Xylenecyanol FF (X4126)
Sigma-Aldrich hat RNA-Probenpuffer mit (R1386) oder ohne Ethidiumbromid (R4268) im Angebot.
- SYBR® Green-Nukleinsäurefärbung (S9430) oder Ethidiumbromid: 0,5 µg/ml, hergestellt in destilliertem Wasser
- Transilluminator
Vorgegossene Agarosegele
Sigma-Aldrich hat vorgegossenes 1,25 % Agarosegel für RNA (P6222) im 8-Well-Format im Angebot. Dieses vorgegossene Gel enthält kein Ethidiumbromid. Fahren Sie mit dem Schritt „Laufenlassen des Gels“ fort, falls vorgegossene Gele verwendet werden.
Alternativ können Sie mit folgendem Verfahren Ihre eigenen Agarosegele gießen.
Herstellen von Agaroselösung
- Messen Sie die geeignete Menge Agarosepulver ab und geben Sie es in einem Becherglas oder Kolben zu 1 X MESA-Puffer.
Hinweis: Die Agarosemenge ist von dem erforderlichen Anteil in dem Gel abhängig. Das Volumen der Agaroselösung muss entsprechend der Größe der verwendeten Gelwanne hergestellt werden. - Lösen Sie die Agarose durch Erwärmen auf einem Heizrührer. Alternativ kann sie in einer Mikrowelle erwärmt werden. Dabei muss sie jede Minute verwirbelt werden, bis die Agarose komplett gelöst ist.
- Wenn die Agarose auf 50–60°C abgekühlt ist, geben Sie Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,5 µg/ml) zu der Lösung. Eine weitere Alternative ist das Eintauchen des Gels in Ethidiumbromidlösung nach der Elektrophorese.
WICHTIG: Ethidiumbromid ist ein krebserregender Stoff. Tragen Sie stets Handschuhe und eine Maske, wenn Sie mit Ethidiumbromid arbeiten. - Bereiten Sie die Gelwanne für das Gießen des Gels vor, während die Agarose abkühlt, sodass die Agaroselösung nicht ausfließt, bevor sie aushärtet. Dies kann durch Gussdämme, einen Gelgießstand oder Abdichten mit traditionellem Laborklebeband sichergestellt werden. Platzieren Sie den Kamm in den Rillen und die Wanne in einer ebenen horizontalen Position.
- Gießen Sie die Agaroselösung langsam, sodass sie gleichmäßig in der Wanne verteilt wird und keine Luftblasen in dem Gel eingeschlossen werden. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren.
Entfernen Sie die Kämme und geben Sie das Gel mit der Wanne in den Hauptbehälter, den Sie mit 1 X Elektrophoresepuffer füllen, bis das Gel gerade mit Puffer bedeckt ist.
Aufbereitung von RNA-Proben
- Isolieren Sie die RNA mit TRI-Reagens® (T9424) oder dem GenElute™-Kit für Säugetierzellen oder -gewebe (RTN70, RTN10 und RTN350) aus Zellen oder Gewebeproben.
- Messen Sie zum Bestimmen der Qualität und Konzentration der RNA die Absorption der Proben bei 260 nm und 280 nm. Das Verhältnis der Absorption A260/A280 im Bereich von 1,8 bis 2,1 steht für eine gute Qualität der RNA. Für einen wirksamen Nachweis durch Agarose-Gelelektrophorese sind mindestens 5 µg RNA erforderlich.
- Mischen Sie ein Volumen RNA-Probe mit 2–5 Volumen Probenpuffer.
- Erwärmen Sie die Probe für 10 Minuten auf 65 °C und kühlen Sie sie sofort auf Eis, um eine Renaturierung der RNA-Moleküle zu verhindern.
Laufenlassen des Gels
- Laden Sie die Proben vorsichtig mit Pipetten in die Wells. Ein geeigneter Marker, der RNA-Fragmente verschiedener Größen enthält (R7020, R7644), kann bei Bedarf auch beladen werden.
- Platzieren Sie den Deckel auf dem Behälter und schließen Sie die Energieversorgung an. Eine typische Spannung zum Laufenlassen der Proben in Agarosegelen beträgt 90–150 V.
- Sie sollten die Laufmittelfront mit Pyronin Y (P9172), Bromphenolblau (B8026) oder Xylencyanol (x4126) überwachen.
| Gelkonzentration (% w/v) | Effektiver Trennungsbereich (bp) | Xylencyanol (bp) | Bromphenolblau (bp) |
|---|---|---|---|
| 3,5 | 1.000–2.000 | 460 | 100 |
| 5,0 | 50–500 | 260 | 65 |
| 8,0 | 60–400 | 160 | 45 |
| 12,0 | 40–200 | 70 | 20 |
| 15,0 | 25–150 | 60 | 15 |
| 20,0 | 6–100 | 45 | 12 |
Gelfärbung und Ansicht
Gele mit integriertem Ethidiumbromid:
- Geben Sie das Gel nach der Elektrophorese in einen UV-Transilluminator und erhalten Sie die Abbildung des Gels.
- Die Proben erscheinen als helle Banden.
Gele ohne integriertes Ethidiumbromid:
- Waschen Sie das Gel vorsichtig 10 Minuten lang in RNase-freiem, destilliertem Wasser, um Formaldehyd zu entfernen.
- Geben Sie das Gel nach der Elektrophorese für 15–30 min in SYBR® Green-Nukleinsäurenfärbung (1:10.000) oder 0,5 µg/ml Ethidiumbromid-Färbelösung.
- Falls eine SYBR® Green-Nukleinsäurenfärbung verwendet wird, kann die Abbildung des Gels direkt nach der Färbung erhalten werden.
- Falls Ethidiumbromid verwendet wird, entfärben Sie das Gel für 10–30 min in destilliertem Wasser. Stellen Sie dabei sicher, dass das Gel vollständig in das Wasser eingetaucht ist.
- Geben Sie das Gel in einen UV-Transilluminator und erhalten Sie die Abbildung des Gels.
- Die Proben erscheinen als helle Banden.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA
Polyacrylamidgele werden durch die Umsetzung von Acrylamid mit Bis-Acrylamid (N,N‘-Methylenbisacrylamid) gebildet, die zu einer hochgradig vernetzen Gelmatrix führt. Acrylamidgele können DNA-Fragmente mit einer Differenz von selbst 0,2 % der Länge trennen. Während Proteine vor der Trennung auf Polyacrylamid durch SDS denaturiert werden müssen, sind DNA-Moleküle negativ geladen und müssen nicht denaturiert werden. Verglichen mit Agarosegelen können Polyacrylamidgele größere Probenmengen aufnehmen und eine höhere Auflösung der DNA-Fragmente bieten.
Obwohl vorgegossene PAGE-Gele für DNA gern verwendet werden, sind sie mit hohen Kosten verbunden, falls PAGE ein regelmäßiges Verfahren in dem Labor ist. Geübte Laboranten können PAGE-Gele ohne große Mühe für einen Bruchteil der Kosten von vorgegossenen Gelen herstellen. PAGE-Gele, die vor Ort hergestellt werden, bieten eine bessere Auflösung und helfen beim Erzielen von konsistenten Ergebnissen.
Protokoll: Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA
Erforderliche Materialien und Reagenzien
Vertikale Elektrophoresekammer mit Energieversorgung, Glasplatten, Abstandshaltern und Kämmen
- 30 % Polyacrylamidlösung (durch einen 0,45-mmol/l-Filter filtrieren und bei 4 °C im Dunkeln lagern):
29 g Acrylamid
1 g Bis-Acrylamid
100 ml bidestilliertes Wasser
- 10 % Ammoniumpersulfatlösung
- TEMED
- Elektrophoresepuffer:
1 X TBE, hergestellt in destilliertem Wasser:
89 mmol/l Tris (pH-Wert 7,6)
89 mmol/l Borsäure
2 mmol/l EDTA
- 5 X Gelprobenpuffer:
80 % Glycerin 75 %
Bromphenolblau (B5525) 0,25 %
Xylencyanol (X4126) 0,25 %
1 mol/l Tris (pH-Wert 7,4) 10 mmol/l
5 mol/l NaCl 10 mmol/l
0,5 mmol/l EDTA 10 mmol/l
10 % SDS 0,1 %
- Ethidiumbromid 0,5 µg/ml
- Transilluminator
WICHTIG: Acrylamid und Bis-Acrylamid sind von Natur aus neurotoxisch. Beim Durchführen aller Schritte sollten puderfreie Handschuhe getragen werden.
Verfahren
- Reinigen Sie die Glasplatten und Abstandshalter der Gelgießeinheit mit entionisiertem Wasser und Ethanol.
- Ordnen Sie die Platten mit den Abstandshaltern auf einer stabilen Oberfläche an.
- Stellen Sie die Gellösung abhängig vom erforderlichen Anteil im Gel mit folgenden Volumen (für 12 ml) her.
| Gel % | 30 % Acrylamid (ml) | 10 X TBE (ml) | 10 % APS (µl) | Wasser (ml) | TEMED*(µl) |
|---|---|---|---|---|---|
| 8 % | 3,2 | 1,2 | 200 | 7,6 | 10 |
| 10 % | 4,0 | 1,2 | 200 | 6,8 | 10 |
| 12 % | 4,8 | 1,2 | 200 | 6,0 | 10 |
* TEMED muss der letzte Bestandteil sein, der hinzugefügt wird.
- Gießen Sie die Gellösung in die mit dem Abstandshaltern angeordneten Platten. Setzen Sie den Kamm sofort ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in dem Gel oder nahe der Wells eingeschlossen sind. Lassen Sie das Gel etwa 30–60 min bei Raumtemperatur erstarren
Das polymerisierte Gel kann in Frischhaltefolie gewickelt und für den künftigen Gebrauch bei 4 °C aufbewahrt werden.
- Wenn Sie bereit zum Durchführen der Elektrophorese sind, geben Sie die Platten mit dem Gel in die Apparatur und füllen Sie die Kammern mit 1 X TBE-Puffer. Es wird empfohlen, bei 5 V/cm einen 10-minütigen Vorlauf durchzuführen.
- Bereiten Sie die Oligonukleotidproben auf, indem Sie 1 µl Probe mit 5 µl 5 X Gelprobenpuffer mischen. Laden Sie die Proben vorsichtig in die Wells, ohne Luftblasen einzuschließen.
- Große Gele können bei ~70 V für 14–16 h oder bei 125–150 V für 2–4 h laufen gelassen werden oder bis die Laufmittelfront die Unterkante des Gels erreicht. Stellen Sie sicher, dass kein übermäßiges Erwärmen stattfindet. Alternativ können die Proben bei einer höheren Spannung in einem Kühlraum laufen.
- Öffnen Sie die Glasplatten mit einem Spatel, trennen Sie die obere Glasplatte ab. Färben Sie das Gel für 5–10 min mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromidlösung, während es noch an die untere Glasplatte anhaftet.
- Tauchen Sie das Gel auf der Glasplatte für 10–30 min in destilliertes Wasser, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und die Hintergrundfärbung zu senken.
- Wickeln Sie das Gel und die Platte in Frischhaltefolie, geben Sie sie in einen UV-Transilluminator und erhalten Sie die Abbildung des Gels.
- Die Proben erscheinen als helle Banden.
- Die gewünschten Banden können mit einem dünnen Skalpell geschnitten und entsprechend verarbeitet werden, um die DNA wiederzufinden.
Falls 35S- oder 33P-Nukleotide in die Oligonukleotide integriert sind, führen Sie nachstehendes Verfahren durch:
- Tauchen Sie das Gel für 15 min in 10 % Essigsäure.
- Tupfen Sie das Gel trocken und wickeln Sie es in Frischhaltefolie.
- Trocknen Sie das Gel 20 min oder länger bei 80 °C in einem Vakuumtrockner.
- Entfernen Sie die Frischhaltefolie und setzen Sie das Gel im Dunkeln einem Röntgenfilm aus.
Abbildung 3.Vertikales Elektrophoresesystem
Literatur
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