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[Startseite](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de)[Polymerase-Kettenreaktion Anwendungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/applications/genomics/pcr)Standard-PCR-Protokoll
# Standard-PCR-Protokoll
## So führt man eine PCR durch
Ein Standard-PCR-Versuch (Polymerase-Kettenreaktion) besteht aus vier Schritten:
1. Die erforderlichen Reagenzien oder den Mastermix sowie die Matrize in die PCR-Röhrchen geben.
2. Mischen und zentrifugieren.
\*Mineralöl hinzufügen, um eine Verdunstung in einem Thermocycler ohne beheizbaren Deckel zu verhindern.
3. Amplifizieren Sie gemäß den Parametern des Thermocyclers und der Primer.
4. Die amplifizierte DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Ethidiumbromid-Färbung auswerten.
Im Folgenden werden diese Schritte zusammen mit Tipps zur Auswahl der Materialien und Reagenzien näher erläutert. Es handelt sich hierbei um ein grundlegendes PCR-Protokoll unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase.
## PCR-Schritte und wesentliche PCR-Komponenten
Die Fehlerbehebung bei einer PCR-Reaktion hängt von vielen Faktoren ab. Sehen Sie sich diese Animation an, um zu erfahren, wie die Auswahl der richtigen Komponenten und Zyklusbedingungen für Ihre Anforderungen dazu beitragen kann, optimale Ergebnisse zu erzielen.
* * *
Weitere Protokolle für andere Polymerasen oder fortgeschrittene PCR-Techniken finden Sie im Abschnitt [„Protokolle“](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction) unseres Leitfadens zu PCR-Technologien.
Erfahren Sie auf unserer [Seite „PCR-Grundlagen“](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification) mehr über die Standard-PCR, einschließlich einer Erklärung, was sie ist.
## [](https://www.sigmaaldrich.com)Reagenzien: Was wird für die PCR benötigt?
Bei der PCR verwendetes ReagenzEmpfohlenes Produkt
*Taq*-DNA-PolymeraseWählen Sie die *Taq*-DNA-Polymerase nach Ihren Präferenzen aus. (Siehe separate [Tabelle zu *Taq*-Polymerasen](https://www.sigmaaldrich.com#taqdnapolymerase) weiter unten.)
Wasser in PCR-QualitätPCR-Reagenzwasser
Auf Arbeitskonzentration
verdünnte Primer 10 µM-Arbeitslösungen sind für die meisten Assays ausreichend.
Oligos[Kundenspezifische Oligos](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes)
Zu amplifizierende DNAVom Forscher bereitgestellt
Spezielle Pipetten
ThermocyclerMit verschiedenen Well-Block-Größen oder im Multiformat
Sterile Filterpipettenspitzen
Sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit SchraubverschlussCorning®-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss
PCR-Röhrchen oder -PlattenWählen Sie passend zum Zyklierer:
Einzelne dünnwandige 200-µL-PCR-Röhrchen
200-µL-Streifenröhrchen
Multiwell-Platten und Plattenverschluss
dNTP-MixDesoxynukleotid-Mix mit je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
\*Fertigmischungen enthalten bereits dNTPs
## Was ist *Taq*-Polymerase?
Die Taq-DNA-Polymerase ist ein thermostabiles Enzym*,* das aus dem thermophilen Bakterium *Thermus aquaticus* gewonnen wird*.* Sie wird häufig zur Amplifikation von DNA-Fragmenten in der PCR verwendet. Das Enzym liegt in rekombinanter Form vor und wird in *E. coli* exprimiert. Es hält wiederholten Erhitzungen auf 95 °C (wie sie bei der PCR-Technik erforderlich sind) stand, ohne nennenswerten Aktivitätsverlust zu erleiden. Das Enzym weist bei SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ca. 94 kDa auf und zeigt keine nachweisbare Endonuklease- oder Exonukleaseaktivität. Es verfügt über eine 5'→3'-DNA-Polymeraseaktivität sowie eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität. Jede Charge der Taq-DNA-Polymerase wird auf PCR-Amplifikation und doppelsträngige Sequenzierung geprüft. Das Enzym wird in einer Konzentration von 5 Einheiten/µL geliefert und enthält einen optimierten 10x-Reaktionspuffer.
[](https://www.sigmaaldrich.com)
### Standard*-Taq*-DNA-Polymerase
Wählen Sie anhand der folgenden Tabelle eine für Ihre Reaktionsbedingungen geeignete Mischung der Taq-DNA-Polymerase aus. Wählen Sie zwischen klaren oder rot gefärbten Formulierungen mit und ohne Magnesiumchlorid (MgCl₂) oder einem vorgefertigten Readymix bzw. Mastermix mit Puffer und dNTPs.
Enthält MgCl₂ MgCl₂ abtrennenFertigmischung
Klare Formulierung ohne FarbstoffMit rotem Farbstoff für die direkte Beladung von GelenKlare Formulierung ohne FarbstoffMit rotem Farbstoff zum direkten Auftragen auf GeleKlare Formulierung ohne Farbstoff
*Taq*-DNA-Polymerase aus *Thermus aquaticus* (D1806)REDTaq®-DNA-Polymerase
(D4309)Taq-DNA-Polymerase aus *Thermus aquaticus*, ohne MgCl₂ (D4545)*REDTaq®* ReadyMix™ PCR-Reaktionsmix
(R2523)ReadyMix™ *Taq*-PCR-Reaktionsgemisch
(P4600)
__Einheitsdefinition:__ Eine Einheit bindet innerhalb von 30 Minuten bei 74 °C insgesamt 10 nmol Desoxyribonukleosidtriphosphate in säureausfällbare DNA ein.
## [](https://www.sigmaaldrich.com)Vorgehensweise: Schritte der PCR
Die optimalen Bedingungen für die Konzentration von Taq-DNA-Polymerase, Template-DNA, Primern und MgCl₂ hängen vom verwendeten System ab. Es kann erforderlich sein, die optimalen Bedingungen für jede einzelne Komponente zu ermitteln. Dies gilt insbesondere für die Taq-DNA-Polymerase, die Zyklusparameter und die MgCl₂-Konzentration. Es wird empfohlen, das Enzym und das MgCl₂ zu titrieren, um die optimale Effizienz zu ermitteln.
1. __Geben Sie die Reagenzien__ in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge __in ein Röhrchen geeigneter Größe__. (Wählen Sie die für den Reaktionsaufbau geeignete Tabelle aus: Standard- oder Readymix-Reagenzien.) Bei einer großen Anzahl von Reaktionen sollte ein Mastermix ohne Matrize angerichtet und in Reaktionsröhrchen aliquotiert werden. Am Ende sollte die Matrize in die entsprechenden Röhrchen gegeben werden.
### Standard-PCR-Reaktion
BetragKomponenteEndkonzentration
w µLWasser
5 µL10x PCR-Puffer ([P2192](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P2192) oder [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P2317))\*1x
1 µLDesoxynukleotid-Mix200 µM
w µLVorwärtsprimer
(typischerweise 15–30 Basen lang)0,1–0,5 µM
x µL
Reverse-Primer
(typischerweise 15–30 Basen lang)
0,1–0,5 µM
0,5 µl
*Taq*-DNA-Polymerase*
0,05 Einheiten/µL
y µL
Matrizen-DNA (typischerweise 10 ng)
200 pg/µL
z µL
25 mM MgCl₂ (nur in Verbindung mit Puffer [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P2317) verwenden)
0,1–0,5 mM
__50 µL__
__Gesamtreaktionsvolumen__
\*Puffer und *Taq*-Polymerase zusammen kaufen: D1806, D4309 oder D4545
### Fertigmischung für die PCR-Reaktion
BetragKomponenteEndkonzentration
25 µL
Readymix ([R2523](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/R2523) oder [P4600](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P4600))
w µL
Vorwärtsprimer
(typischerweise 15–30 Basen lang)
0,1–0,5 µM
x µL
Reverse-Primer
(typischerweise 15–30 Basen lang)
0,1–0,5 µM
y µL
Matrizen-DNA (typischerweise 10 ng)
200 pg/µL
z µL
Wasser
__50 µL__
__Gesamtreaktionsvolumen__
2\. __Vorsichtig mit dem Vortex mischen und kurz zentrifugieren,__ damit sich alle Bestandteile am Boden des Röhrchens sammeln.
Hinweis: Geben Sie 50 µL Mineralöl in jedes Röhrchen, um eine Verdunstung zu verhindern, falls Sie einen Thermocycler ohne beheizbaren Deckel verwenden.
3\. __Amplifikation durchführen.__ Die Amplifikationsparameter variieren je nach den verwendeten Primern und dem Thermocycler. Es kann erforderlich sein, das System für die jeweiligen Primer, die Matrize und den Thermocycler zu optimieren.
### Typische Zyklusparameter
Es werden 25–30 Amplifikationszyklen empfohlen.
PCR-SchrittTemperatur °CDauer
Denaturierung der Matrize
94 °C
1 min
Primer
annealen 55 °C
2 min
Verlängerung
72 °C
3 min
4\. __Die amplifizierte DNA kann mittels [Agarose-Gelelektrophorese](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/nucleic-acid-gel-electrophoresis/nucleic-acid-electrophoresis) und anschließender Ethidiumbromid-Färbung ausgewertet werden.__
Hinweis: Die Mineralölschicht kann durch eine einmalige Chloroform-Extraktion (1:1) entfernt werden, wobei die wässrige Phase gewonnen wird.
### [](https://www.sigmaaldrich.com)Reagenzien für die Nukleinsäure-Elektrophorese
- Agarose (Fertiggele, Pulver usw.)
- Puffer wie MOPS-EDTA-Natriumacetat, Tris-Acetat-EDTA (TAE) oder Tris-Borat-EDTA (TBE)
- Gel-Auftragslösung und Probenpuffer für RNA
- Elektrophorese-Anfärbemittel oder Farbstoff wie Ethidiumbromid
1\.
Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. [https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695](https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695)
2\.
Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. [https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371](https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371)
3\.
Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.
4\.
Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.
5\.
Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. [https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436](https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436)
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Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.
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Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. [https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989](https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989)
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11\.
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## Erklärung zur Lizenz des Labels
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## Materialien
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