[Direkt zum Inhalt](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de) Produkte Warenkorb0 ATDE Produkte [Anmelden / Registrieren](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Bestellungssuche](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/order-lookup) [Schnelleinkauf](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/quick-order) Warenkorb0 [Startseite](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/applications/genomics/qpcr)Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration # Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration ## Optimierung der qPCR-Bedingungen Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.  Ein Ansatz zur Optimierung der Primerkonzentrationen ist die Erstellung einer Reaktionsmatrix. Sie wird verwendet, um eine Reihe von Konzentrationen für jeden Primer im Abgleich zu verschiedenen Konzentrationen des Partnerprimers zu testen. Im Beispiel, das in diesem Protokoll enthalten ist, wird eine 6×6-Matrix mit sechs Konzentrationen (z. B. 50 nM bis 800 nM) getestet. Die in diesem Protokoll angegebenen Mengen erlauben es, jede Bedingung in zweifacher Ausführung durchzuführen. ## Für das Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration verwendete Ausrüstung - Gerät für die quantitative PCR - Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional) ## Reagenzien - Geeignetes Assay-Template, z. B. 1:10 verdünnte cDNA, gDNA oder synthetisches Oligo-Template. - KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - abhängig vom Gerät, siehe __Tabelle P4-6__ in Bezug auf Instrumentenkompatibilität). - Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden. - Konzentrierte Stammlösung für Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM Arbeitslösung: \- Kundenspezifische Oligos können unter sigmaaldrich.com/oligos bestellt werden. Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, (Art.-Nr. KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Art.-Nr. KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, (Art.-Nr. KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, (Art.-Nr. KCQS03) __Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    Tabelle P13-31.Auswahlhilfe für SYBR Green PCR-Mix ## Materialien - Sterile Filter-[Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909) - PCR-Röhrchen und -Platten - Treffen Sie ihre Auswahl, um das gewünschte Format zu erhalten: • Einzelne dünnwandige 200-μl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114) • Platten \- 96-Well-Platten (Z374903) \- 384-Well-Platten (Z374911) • Plattendichtungen \- ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438) - ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553) ### Anmerkungen zu diesem Protokoll - Die cDNA wird mit Hilfe eines Zufallsprimers oder einer Oligo-dT-Priming-Methode erzeugt und für die Verwendung 1:10 verdünnt. Darüber hinaus kann jedes geeignete alternative Template verwendet werden. - Alle Proben werden in zweifacher Ausführung entsprechend dem Plattenlayout (__Abbildung P13-18__) durchgeführt. ![Schematische Darstellung des Plattenlayouts für die Primer-Optimierung](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/qpcr/representation-of-the-primer-optimization.jpg "Schematische Darstellung des Plattenlayouts für die Primer-Optimierung") __Abbildung P13-18.__Schematische Darstellung des Plattenlayouts für die Primer-Optimierung ## Methode *__Hinweis:__* 2.0 μl jedes Primers werden zu der Reaktion mit einem Gesamtvolumen von 20 μl hinzugefügt. Damit die gewünschte Endkonzentration erreicht wird, sind die Werte der Primer-Stammlösungen 10-mal so hoch wie die erforderliche Konzentration. 1.    Unter Verwendung der 10 μM-Primer-Stammlösungen wird eine Verdünnung der beiden Primer-Stammlösungen auf 0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 μM gemäß __Tabelle P13-32__ vorgenommen. Endkonzentration (μM)Volumen (μl) H2OVolume (μl) 10 μM StammVolumen gesamt (μl) 0,547,52,550 145550 2401050 4302050 6203050 82080100 Tabelle P13-32.Primer-Verdünnungsschema für die Optimierung der Primerkonzentration. 2.    Es wird ein qPCR-Mastermix gemäß  __Tabelle P13-33__ vorbereitet        (*__Hinweis:__* Template und cDNA werden in Schritt 5 separat hinzugefügt). Gut mischen. ReagenzienVolumen (μl) pro 20 μl-EinzelreaktionVolumen (μl) für die gesamte Platte (84+10 % Pipettierfehler)   2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™10924 Wasser in PCR-Qualität3277,2 Referenzfarbstoff (optional)192,4 Template, z. B. cDNA (verdünnt 1:5 bis 1:10 aus Stamm)2* Vorwärtsprimer2* Rückwärtsprimer2* Tabelle P13-33.Reaktions-Mastermix für die Optimierung der Primerkonzentration. *__\*Hinweis:__* Fügen Sie cDNA und Primer __nicht__ vor Schritt 5 hinzu. 3.    Entnehmen Sie 184,8 μl (für 12× NTC) des Mastermix aus Schritt 2 in ein separates Röhrchen, um die Negativkontrolle (NTC) vorzubereiten. 4.    Fügen Sie 26,4 μl dH2O zu der NTC-Mischung aus Schritt 3 hinzu (um das Template zu ersetzen).        *Hinweis:* Die NTC-Mischung zur späteren Verwendung auf Eis legen. 5.    Fügen Sie 158,4 μl cDNA-Template zum restlichen Mastermix aus Schritt 2 hinzu. Mastermix auf Eis legen. 6.    Geben Sie 2,0 μl der entsprechenden Rückwärtsprimer-Verdünnungen gemäß __Abbildung P13-18__ in die PCR-Platte; fügen Sie der NTC-Reihe ebenfalls eine Konzentration von 800 nM hinzu. 7.    Geben Sie 2,0 μl der entsprechenden Vorwärtsprimer-Verdünnungen gemäß __Abbildung P13-18__ in die PCR-Platte. 8.    Aliquotieren Sie 16 μl des Mastermix aus Schritt 5 in die PCR-Platte in die den Testpositionen entsprechenden Wells. 9.    Aliquotieren Sie 16 μl Mastermix aus Schritt 4 für NTC-Reaktionen in die PCR-Platte. 10.  Platten versiegeln und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt). 11.  Führen Sie die Proben gemäß dem zweistufigen Protokoll in __Tabelle P13-34__ durch. Die Schritte 1 und 2 werden mit 40 Zyklen wiederholt, gefolgt von einer Dissoziationskurvenanalyse. | | | | |-----------------------------------------------------|------------|----------| | Zyklusbedingungen | Temp. (ºC) | Zeit (s) | | Anfängliche Denaturierung/Hot Start | 95 | 30 | | __Die Schritte 1-2 werden in 40 Zyklen wiederholt__ | | | | Schritt 1 | 95 | 5 | | Schritt 2 | 60 | 30 | Tabelle P13-34.PCR-Zyklusbedingungen für die Optimierung der Primerkonzentration. *__Hinweis:__* Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung). ## Materialien Bitte entschuldigen Sie, es ist ein unerwarteter Fehler aufgetreten Response not successful: Received status code 500 __Zugehörige Artikel__ - [Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [PCR-Assay-Optimierung und Validierung](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [DNA-Oligonukleotid-Synthese](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Verbrückte Nukleinsäure](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Quantifizierung von Oligonukleotiden](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Fehlerbehebung in der RT-PCR/ RT-qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [PCR/qPCR-Datenanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/data-analysis) - [Zweifach markierte Sonden](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/dual-labeled-probes) - [Mehr anzeigen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Zugehörige Produktkategorien__ - [Dichtungsfilme, -folien und -klebebänder](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) Oben __Melden Sie sich an, um fortzufahren.__ Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto. 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