[Direkt zum Inhalt](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de) Produkte Warenkorb0 ATDE Produkte ProdukteAnwendungenDienstleistungenRessourcenUnterstützung [Anmelden / Registrieren](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Bestellungssuche](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/order-lookup) [Schnelleinkauf](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/quick-order) Warenkorb0 [Startseite](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/applications/genomics/qpcr)Protokoll zur Bestimmung der qPCR-Effizienz # Protokoll zur Bestimmung der qPCR-Effizienz ## Optimierung der qPCR-Bedingungen Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen. Sobald ein Assay optimiert wurde, ist es wichtig, die Reaktionseffizienz zu verifizieren. Diese Informationen sind wichtig für die Berichterstattung und den Vergleich von Assays. In diesem Beispielprotokoll wird die Assay-Effizienz über einen breiten und einen engen dynamischen Bereich von cDNA-Konzentrationen verglichen. In der Praxis ist es üblich, abhängig vom erwarteten Zielbereich in den Proben einen einzelnen Testbereich auszuwählen, sodass das angegebene Protokoll entsprechend den Anforderungen des Experiments angepasst werden kann. In diesem Beispiel wird die Effizienz anhand von 10-fachen und 2-fachen Verdünnungsreihen berechnet. Die Standardkurve soll den erwarteten Expressionsbereich für die Gene von Interesse umfassen. Beachten Sie, dass die Proportionalität der cDNA-Ausbeute in Bezug auf die RNA-Eingabe bei Verwendung des ReadyScript® RT-Kits linear ist, sodass dieses Experiment an die RT-qPCR angepasst werden kann, wenn dieses System verwendet wird, indem 1) die RNA verdünnt und die RT-Reaktionen durchgeführt werden und 2) anschließend die qPCR mit jeder der resultierenden cDNA-Proben durchgeführt wird (Beispiele siehe [Reverse Transkription](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription)).  Dies ist jedoch nicht immer der Fall und gilt nicht für alle Reverse-Transkription-Kits oder -Protokolle. Es ist entsprechend zu überprüfen, bevor dieses Protokoll an ein anderes Kit angepasst wird  ## Ausrüstung - Gerät für die quantitative PCR - Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional) ## Reagenzien - DNA, die als Template für die Standardkurve verwendet werden soll (z. B. cDNA, gDNA oder ein synthetisches Template). - KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ ([KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS00) - abhängig vom Instrument, __Tabelle P4-6__). - Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität ([W1754](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/W1754) oder [W4502](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/W4502)) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden. - Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Testgene (Stammlösung bei 10 μM). Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, ([Art.-Nr. KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS00))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox ([Art.-Nr. KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS01))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, ([Art.-Nr. KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS02))KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, (;[Art.-Nr. KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS03)) __Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    Tabelle P17-42.Auswahlhilfe für SYBR® Green PCR Mix™. ## Materialien - Sterile Filter-[Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/CLS430909) - PCR-Röhrchen und -Platten. Eins auswählen, um das gewünschte Format zu erhalten: •    Einzelne dünnwandige 200 μl PCR-Röhrchen ([Z374873](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z374873) oder [P3114](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P3114)) •    Platten \- [96-Well-Platten (Z374903)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z374903)       - [384-Well-Platten (Z374911)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z374911) •    Plattendichtungen \- [ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z734438)       - [ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z722553) ### Anmerkungen zu diesem Protokoll - cDNA wird mit Hilfe von Zufalls-Priming oder der Oligo-dT-Methode erzeugt (siehe [Standardprotokoll für die reverse Transkription (zweistufig)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step)). Das RT-Produkt wird verdünnt, um die Standardkurven zu erstellen (als Beispiele werden 1:2 und 1:10 angegeben). RNA kann auch verdünnt und cDNA aus jeder Verdünnung mit dem ReadyScript® Kit synthetisiert werden, oder es kann ein einstufiger RT-qPCR-Ansatz gewählt werden, indem die RNA verdünnt und der einstufige RT-qPCR-Ansatz im Protokoll der reversen Transkription (einstufiger SYBR® Green I-Farbstoffnachweis) und dem [Protokoll der reversen Transkription (einstufiger Sondennachweis)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/reverse-transcription-one-step-probe-detection) befolgt wird. Alternativ können die DNA-Templates so ersetzt werden, dass der erwartete Cq-Bereich zwischen Cq 15 und Cq 38 liegt. - Jede Konzentration der seriellen Verdünnungen wird in Form von zweifachen Reaktionen durchgeführt. ## Methode 1.    Bereiten Sie einen qPCR-Mastermix vor, der für 40 Reaktionen gemäß __Tabelle P16-40__ ausreicht. Dadurch können zusätzliche Pipettierfehler ausgeglichen werden, da 32 Reaktionen durchgeführt werden (__Tabelle P16-41__). ReagenzienVolumen (μl) pro 20 μl-EinzelreaktionVolumen (μl) für 40 Reaktionen 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™10400 Vorwärtsprimer (10 μM)0,936 Rückwärtsprimer (10 μM)0,936 Wasser in PCR-Qualität3,2128 Tabelle P16-40.Reaktions-Mastermix für die Erstellung von 1:2- und 1:10-Standardkurven. 2.    Verdünnen Sie die DNA durch eine Serie von 1:10 und 1:2, wobei 7 Verdünnungspunkte für jede Serie abgedeckt werden (__Tabelle P16-41__, Plattenaufbau für die DNA-Verdünnung). 3.    Geben Sie 5 μl der entsprechenden Template-Verdünnung in die definierten Wells (__Tabelle P16-41__, Plattenlayout für DNA-Verdünnung). Plattenlayout für DNA-Verdünnung Platte Säule1234Verbleibende Platte A1111  B0,10,10,50,5  C0,010,010,250,25  D0,0010,0010,1250,125  E0,00010,00010,06250,0625  F0,000010,000010,031250,03125  G0,0000010,0000010,0156250,015625  HNTCNTCNTCNTC  Tabelle P16-41.Diagramm der ersten vier Spalten eines 96-Well-Plattenlayouts, in dem die Position der Verdünnungen des Standardkurven-Templates dargestellt wird. Die angegebene Verdünnung bezieht sich auf die ursprüngliche Stammlösung. Bei Verwendung eines künstlichen Templates ist es möglich, die Kopienzahl (relativ zu den OD-Messwerten) zu berechnen. 4.    Geben Sie 15 μl des Mastermix in jedes Well (__Tabelle P16-41__). 5.    Verschließen Sie die Röhrchen oder versiegeln Sie die Platte und beschriften Sie diese. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt) 6.    Lassen Sie die Proben gemäß dem folgenden zweistufigen Protokoll durchlaufen. Die Schritte 1-2 werden in 40 Zyklen wiederholt. Verfolgen Sie die Amplifikation mit einer Standard-Dissoziationskurvenanalyse. | | | | |------------------------------------------------------|------------|----------| | Zyklusbedingungen | Temp. (ºC) | Zeit (s) | | Anfängliche Denaturierung/Hot Start | 95 | 30 | | __Die Schritte 1-2 werden in 40 Zyklen wiederholt.__ | | | | Schritt 1 | 95 | 5 | | Schritt 2 | 60 | 30 | Tabelle P16-42.PCR-Zyklusbedingungen für die Erstellung von Standardkurven. *__Hinweis:__* Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung). ## Materialien Bitte entschuldigen Sie, es ist ein unerwarteter Fehler aufgetreten Response not successful: Received status code 500 __Zugehörige Artikel__ - [Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [PCR-Assay-Optimierung und Validierung](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [DNA-Oligonukleotid-Synthese](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/dna-oligonucleotide-synthesis) - [Verbrückte Nukleinsäure](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq) - [Quantifizierung von Oligonukleotiden](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/quantitation-of-oligos) - [Fehlerbehebung in der RT-PCR/ RT-qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [PCR/qPCR-Datenanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/data-analysis) - [Zweifach markierte Sonden](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/dual-labeled-probes) - [Mehr anzeigen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Zugehörige Produktkategorien__ - [Dichtungsfilme, -folien und -klebebänder](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) Oben __Melden Sie sich an, um fortzufahren.__ Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto. 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Entwicklung. Produktion.__ Wir sind ein führender Anbieter für die globale Life Science Industrie mit Lösungen und Dienstleistungen für die Forschung, die biotechnologische Entwicklung und Produktion sowie die pharmazeutische Entwicklung und Produktion von Medikamenten. [](https://www.sigmaaldrich.com/DE/de) [Sigma-Aldrich® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/sigma-aldrich)[BioReliance® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/bioreliance)[Millipore® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/millipore)[SAFC® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/safc)[Milli-Q® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/milliq)[Supelco® Lösungen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/life-science/supelco) © 2026 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland und/oder ihre Tochtergesellschaften. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich Text und Data Mining für KI-Training und ähnliche Technologien. 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