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HPLC de moléculas grandes

HPLC de moléculas grandes

Biomoléculas são compostos químicos poliméricos grandes, produzidos por células vivas, que atuam como elementos estruturais fundamentais de organismos vivos e realizam muitos processos biológicos essenciais à vida. Os principais tipos de biomoléculas incluem proteínas, peptídeos, polinucleotídeos, carboidratos, lipídios, vitaminas e coenzimas. A natureza de molécula grande e a estrutura das biomoléculas, sua diversidade química, a necessidade de se considerar atividade biológica e as matrizes complexas requerem uma técnica de caracterização eficiente. Embora existam muitas técnicas de separação e análise disponíveis, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a mais comumente usada. Devido a seus muitos grupos funcionais e múltiplas conformações, a análise de biomoléculas por HPLC é baseada em diferentes modos, como fase reversa, exclusão por tamanho ou troca iônica. Independentemente dos modos de separação aplicados, o empacotamento eficiente da coluna e as características químicas consistentes das partículas na fase estacionária são essenciais para uma separação precisa e confiável de biomoléculas.   


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HPLC de biomoléculas em fase reversa

A HPLC em fase reversa (do inglês, RP-HPLC) é uma técnica sensível e versátil, usada para separar e analisar proteínas, fragmentos de proteínas e peptídeos. A RP-HPLC usa uma fase estacionária não polar e uma fase móvel polar. A retenção de proteínas e peptídeos na fase estacionária segue princípios de adsorção e fracionamento. Regiões hidrofóbicas das proteínas se ligam de forma reversível à fase estacionária. Proteínas são eluidas pelo aumento da natureza não polar da fase móvel. A resolução pode ser afetada pelo tamanho do poro, tamanho da partícula, comprimento da coluna e a cadeia de hidrocarbonetos ligada à fase estacionária.

Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)

A cromatografia de exclusão por tamanho (do inglês, SEC) é um modo de cromatografia não desnaturante que separa moléculas por seu tamanho (ou seja, raio hidrodinâmico). Esse modo não depende da interação do analito com a fase estacionária e sim do fluxo de analitos aleatórios através das partículas da fase estacionária. Analitos de alto peso molecular eluem antes, pois são total ou parcialmente excluídos dos poros das partículas da fase estacionária, ao passo que analitos com menor peso molecular eluem depois, já que passam mais tempo navegando pelo caminho tortuoso através da partícula. A SEC foi usada para caracterizar agregados e fragmentos de anticorpos monoclonais (mAbs), estimar pesos moleculares de proteínas desconhecidas e determinar a estabilidade de formulações proteicas.

Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)

A cromatografia de interação hidrofóbica (do inglês, HIC) é um modo cromatográfico que separa analitos com base no grau de interação entre porções de analitos hidrofóbicos e ligantes hidrofóbicos da fase estacionária. Devido a seu menor peso molecular e menor propensão a enovelamento, a HIC, em geral, não é usada na separação de peptídeos. Em altas concentrações de sal, camadas de hidratação de proteínas podem ser suficientemente perturbadas, de modo que regiões da superfície hidrofóbicas entrem em contato com a fase estacionária não polar. A escolha do sal é determinada pela série de Hofmeister, que classifica cátions e ânions com base em sua capacidade de romper as camadas de hidratação de proteínas (caotrópicos) ou promover a formação de camadas de hidratação de proteínas (cosmotrópicos). Sais típicos incluem sulfato de amônio, sulfato de potássio e sulfato de sódio. Atualmente, a cromatografia de interação hidrofóbica é usada para determinar o perfil da proporção de medicamento/anticorpo (do inglês, DAR) em conjugados anticorpo-medicamento (do inglês, ADC).

Cromatografia de troca iônica (IEX)

A cromatografia de troca iônica (IEX) é um modo de cromatografia que separa analitos por carga. Proteínas e peptídeos são anfotéricos, o que significa que exibem tanto funcionalidades ácidas quanto básicas. Funcionalidades de proteínas ácidas incluem ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, tirosina e o α-carboxilato da extremidade C. Funcionalidades de proteínas básicas incluem arginina, histidina, lisina e a α-amina da extremidade N. Variantes de carga bioterapêutica podem ser detectadas e separadas por IEX. Variantes de carga podem surgir de um erro de tradução do transcrito de RNA mensageiro (RNAm) e/ou modificações pós-tradução, como desamidação, oxidação ou glicosilação.

Uma coluna de IEX deve ser selecionada com base no ponto isoelétrico (pI) do analito.  Se o pH da fase móvel for menor que o pI, o analito terá carga positiva e se ligará a uma coluna de troca catiônica.  Se o pH da fase móvel for maior que o pI, o analito terá carga negativa e se ligará a uma coluna de troca aniônica.

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade depende de uma interação específica entre um analito e um ligante da fase estacionária. Em um cenário ideal, apenas o analito de interesse entra em contato com a fase estacionária, permitindo que todos os outros componentes da amostra passem pela coluna. Em seguida, uma segunda fase móvel é passada através da coluna para eluir o analito.

A cromatografia de proteína A é a forma mais comum de cromatografia de afinidade usada no setor biofarmacêutico.  A proteína A é uma proteína de superfície de 42 kDa, encontrada na parede celular de S. aureus.  Esta proteína se liga de modo específico à cadeia pesada na região Fc de IgGs, o que torna este um mecanismo ideal para separar IgGs de outros componentes da amostra.  A maioria das colunas de proteína A é fabricada imobilizando-se a proteína em uma partícula orgânica porosa.  Entretanto, foi desenvolvido um formato monolítico para a cromatografia de proteína A, o qual permite alto rendimento de amostra em várias taxas de vazão, sem abrir mão da eficiência.






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