HPLC de moléculas pequenas

HPLC de moléculas pequenas

A análise de HPLC de moléculas pequenas é realizada com mais frequência no modo de separação de fase reversa. Para a separação de compostos polares, a cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) e a cromatografia de fase normal também são adequadas, sendo a HILIC o método preferido. Para a separação de compostos iônicos, os modos de separação por troca iônica e para ânions ou cátions inorgânicos, a cromatografia de íons também pode ser usada.

A coluna de HPLC é embalada com partículas de sílica totalmente porosas, partículas de sílica superficialmente porosas, partículas poliméricas ou consiste em uma monolithic silica rod como fase estacionária. Além disso, são usados óxido de alumina, partículas de zircônia e partículas de carbono. O tamanho típico dos poros do material da fase estacionária para separação de moléculas pequenas está na faixa de 60 Å a 160 Å. Para HPLC, o tamanho típico de partícula da fase estacionária varia de 3 µm a 5 µm; para UHPLC, são usados tamanhos de partícula menores, normalmente 2 µm ou menos. Diferentes seletividades de coluna (modificações) podem ser anexadas à fase estacionária. Uma cadeia de alquil C18 é a química de coluna mais comumente usada na cromatografia de fase reversa (RP). No entanto, outras modificações, como C30, C8, fenil, pentaflourofenil e uma ampla gama de modificações mais polares, bem como modificações com propriedades de troca iônica ou quirais, permitem a separação de quase todos os compostos solúveis em líquidos. A fase móvel para RP-HPLC geralmente consiste em um tampão aquoso ou água e solventes orgânicos miscíveis com água, como acetonitrila ou metanol.

Preparação de amostras para HPLC

Amostras complexas e ricas em matrizes, como alimentos, bebidas, cosméticos, amostras biológicas e formulações farmacêuticas ricas em matrizes (por exemplo, creme, xarope) exigem protocolos eficientes de preparação de amostras para remover componentes indesejados e extrair seletivamente o analito de interesse. Isso é fundamental se for utilizada uma fase estacionária com tamanhos de partículas muito pequenos, como na UHPLC, em que são usadas partículas de 2 µm ou menos. Os métodos comuns de preparação de amostras são a extração líquido-líquido, a extração em fase sólida (SPE) e, para amostras biológicas, também a precipitação de proteínas ao lado da filtração. Além da eluição seletiva do composto-alvo e da pré-concentração, o principal objetivo da preparação da amostra é proteger a fase estacionária do HPLC contra o entupimento causado pela matriz da amostra. As colunas de HPLC baseadas em sílica monolítica pode tolerar a matriz em uma extensão elevada e requer muito menos preparação de amostras do que as colunas particuladas. 

Derivatização

Para algumas moléculas, é necessária a derivatização, antes (pré-coluna) ou depois (pós-coluna) da separação por HPLC. A derivatização converte as moléculas em seus derivados para melhorar a sensibilidade ou a retenção cromatográfica no HPLC. Os reagentes químicos, com propriedades físicas e químicas desejáveis, são usados para a derivatização necessária.