Purificação da amostra

Algumas das técnicas de purificação mais comuns a seguir são utilizadas em laboratório para preparar amostras para análises posteriores.

Diálise

A diálise é uma técnica de purificação utilizada para remover sais ou outras moléculas de baixo peso molecular de uma amostra. Também é utilizada para alterar a composição do tampão de uma amostra. A diálise é uma técnica passiva que requer grandes volumes de tampão.

Troca de tampão e dessalinização

A dessalinização é um método simples para remover sais e outros contaminantes de baixo peso molecular de uma amostra. Também é utilizada para a troca de tampão antes ou depois de diferentes etapas cromatográficas e para a remoção rápida de reagentes para interromper uma reação.

Precipitação fracionada

A precipitação fracionada é usada para remover impurezas grosseiras de pequenos volumes de amostra. As técnicas de precipitação separam frações pelo princípio da solubilidade diferencial. Como as espécies proteicas diferem em seu grau de hidrofobicidade, concentrações elevadas de sal podem aumentar as interações hidrofóbicas entre as proteínas e causar precipitação.

Extração

A preparação de amostras por extração envolve o isolamento de analitos-alvo de uma amostra complexa ou de um volume de amostra muito maior. O processo remove componentes da amostra que podem interferir e bloquear as colunas de HPLC e GC. Ele também aumenta a concentração do analito em um fator de 100 a 5.000, melhorando significativamente a sensibilidade de detecção. Como parte da preparação seletiva e específica da amostra, a extração ajuda a garantir uma análise cromatográfica mais confiável. Os tipos de extração são: extração líquido-líquido, extração em fase sólida (SPE) e microextração em fase sólida (SPME).

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade separa proteínas com base em interações reversíveis entre uma proteína e um ligante específico que foi acoplado a uma matriz cromatográfica. A técnica é altamente seletiva e permite a purificação de proteínas em alta capacidade. A cromatografia de afinidade pode ser utilizada sempre que um ligante adequado estiver disponível para a proteína de interesse.

A purificação por cromatografia de afinidade envolve etapas de captura e eluição. Na fase de captura, a proteína-alvo é ligada de forma específica e reversível a um ligante complementar que foi imobilizado em uma matriz cromatográfica. O objetivo é isolar, concentrar e estabilizar o produto-alvo, conservando sua potência e atividade. Após a lavagem da matriz para remover o material não ligado, a proteína-alvo ligada é recuperada alterando-se as condições para aquelas que favorecem a eluição. A eluição é realizada de forma específica, utilizando um ligante competitivo, ou de forma não específica, alterando o pH, a força iônica ou a polaridade. A eluição permite que a proteína-alvo seja coletada de forma purificada e concentrada.