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Contagem de células e análise de saúde celular

Cientista contando células com o uso de um contador Coulter automatizado portátil

As células em cultura devem ser contadas para monitorar o tempo de duplicação e para quantificação antes de experimentos ou processos de fabricação. Células cultivadas precisam de monitoramento de rotina não apenas quanto à proliferação, mas também quanto à viabilidade, citotoxicidade e outras medidas da saúde celular. A escolha do ensaio depende do tipo de células em cultura, da aplicação do estudo e da produtividade desejada. É fundamental quantificar ou contar as células cultivadas antes do subcultivo ou uso a jusante (downstream) em transfecções, estudos genômicos, criopreservação ou outras manipulações.    


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Contagem de células com o uso de corante azul de tripano e um hemocitômetro

Contagem manual de células

Câmaras de contagem de células, como o hemocitômetro com grades de Neubauer, são dispositivos comuns para contagem manual/visual de células. Uma pequena alíquota de suspensão celular é carregada na câmara de um dispositivo de vidro esmerilhado de precisão e reticulado, no qual ela se dispersa por ação capilar pela grade com marcações. As células são visualizadas em microscópio e contadas com o uso de um contador manual. O volume predefinido da câmara e o sistema de grade são usados para calcular a concentração celular. Sistemas baseados em imagem estão disponíveis para automatização do processo de contagem.

Contagem automatizada de células

Muitos dispositivos para contagem automatizada de células usam os mesmos corantes e princípios de contagem visual utilizados na hemocitometria. Diferentemente dos contadores automáticos de células que dependem do reconhecimento de objetos, os dispositivos baseados no princípio de Coulter se popularizaram devido à sua usabilidade e precisão. Os contadores Coulter bombeiam suspensões celulares através de um sensor que detecta células com base em uma alteração na resistência elétrica. Isso permite a detecção mais confiável de células, até mesmo células pequenas, e contagens de células com alta precisão. Os modelos portáteis de mão (semelhantes a uma pipeta) permitem contagens diretas de células a partir da câmara de cultura.

Ensaios de viabilidade celular

Síntese de DNA: O monitoramento da síntese ativa de DNA nas células é a base de alguns ensaios de proliferação celular. A replicação do DNA pode ser medida incorporando nucleosídeos modificados, como 3H-timidina radioativa ou bromodesoxiuridina (BrdU) não radioativa que é detectada com um anticorpo.

Atividade metabólica: Ensaios colorimétricos que medem atividade metabólica são adequados para analisar proliferação celular, viabilidade celular e citotoxicidade. A redução de sais de tetrazólio, como MTT, XTT e WST-1 em compostos de formazan coloridos ocorre somente em células metabolicamente ativas. A presença de ATP também é um indicador de atividade metabólica. No ensaio de gene repórter com luciferase de vagalume, a ATP produzida pela divisão celular é usada para oxidar a D-luciferina, o que produz uma luz bioluminescente como leitura de resultado.

Exclusão por corante: O corante azul de tripano é comumente usado para contagem de células viáveis. Este método se baseia no princípio de que as células vivas não incorporam o corante, enquanto as células mortas incorporam o corante e ficam azuis ao serem visualizadas em microscópio.

Ensaios fluorescentes de viabilidade celular: A marcação com éster N-succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) é uma escolha popular para medir o número de ciclos de divisão celular concluídos em uma população celular. Outro corante permeável à membrana, a calceína-AM, não é fluorescente por si só, mas emite uma fluorescência verde forte quando hidrolisada em uma célula viável. Por outro lado, o corante nuclear iodeto de propídio (IP) só consegue chegar ao núcleo atravessando a membrana comprometida de células mortas. Como o DNA com IP e com calceína pode ser excitado com luz a 490 nm, o monitoramento simultâneo de células vivas/mortas é possível com um microscópio de fluorescência com excitação única.




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