Ensaios de atividade enzimática
Figura 1.Representação do processo de ensaio de atividade enzimática, começando com um doador de fluorescência e um aceitador de extinção em um substrato que passa por clivagem enzimática para remover o supressor, mostrando um aumento na atividade fluorescente que sinaliza a ocorrência de atividade enzimática.
Os ensaios de atividade enzimática são realizados predominantemente por pesquisadores para identificar a presença ou a quantidade de uma enzima específica em um organismo, tecido ou amostra. Exemplos de tais enzimas incluem α-amilase, catalase, lacase, peroxidase, lisozima e enzimas repórteres, fosfatase alcalina e luciferase. Diversos reagentes e metodologias estão amplamente disponíveis e permitem a investigação de interações específicas entre enzima e substrato. A seleção de uma solução de fluxo de trabalho adequada depende da sensibilidade exigida pelo pesquisador. As soluções colorimétricas são úteis para a detecção, enquanto os reagentes baseados em fluorescência são mais adequados para a quantificação da atividade enzimática.
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Determinando as condições ideais para a atividade enzimática
Embora vários ensaios enzimáticos tenham sido descritos na literatura, é necessário modificar esses procedimentos de acordo com os requisitos exclusivos da enzima sob investigação. A atividade específica de uma enzima depende de vários fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e a concentração de todos os componentes no ensaio. Para condições como o pH, a atividade da enzima geralmente se assemelha a uma curva em forma de sino. A atividade mais alta em um pH específico é relatada como o Vmax, com atividade decrescente observada em ambas as extremidades da curva. Algumas enzimas podem exigir considerações adicionais para compostos que não estão diretamente envolvidos com a reação, como íons metálicos, detergentes e moléculas hidrofóbicas.
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Embora vários ensaios enzimáticos tenham sido descritos na literatura, é necessário modificar esses procedimentos de acordo com os requisitos exclusivos da enzima sob investigação. A atividade específica de uma enzima depende de vários fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e a concentração de todos os componentes no ensaio. Para condições como o pH, a atividade da enzima geralmente se assemelha a uma curva em forma de sino. A atividade mais alta em um pH específico é relatada como o Vmax, com atividade decrescente observada em ambas as extremidades da curva. Algumas enzimas podem exigir considerações adicionais para compostos que não estão diretamente envolvidos na reação, como íons metálicos, detergentes e moléculas hidrofóbicas.
Componentes do ensaio enzimático
Para muitas enzimas, a água é o solvente padrão, pois é o mesmo ambiente à base de água encontrado nas células. Entretanto, os solventes orgânicos são usados em alguns casos em que as enzimas ou os componentes das enzimas são insolúveis em água. Além disso, substratos e cofatores, a catálise para reações enzimáticas, também são componentes essenciais em um ensaio de atividade enzimática. Os substratos e cofatores são geralmente identificados com base em suas funções em condições fisiológicas. Dessa forma, os substratos e cofatores interagem amplamente e podem ser exigidos por uma gama diversificada de enzimas. Os tampões e íons são outros elementos críticos a serem considerados, pois são essenciais para estabilizar o pH durante todo o ensaio e influenciam diretamente a atividade da enzima. Por exemplo, íons metálicos mono ou divalentes podem ser necessários para a atividade catalítica dos cofatores na reação e são essenciais para a atividade da enzima.
Realização de um ensaio enzimático
A preparação dos componentes do ensaio enzimático é uma primeira etapa prática. Em geral, é vantajoso preparar uma grande mistura de ensaio, excluindo um componente ativador, para evitar erros de pipetagem que são inerentes à pipetagem de pequenos volumes. Depois que a mistura do ensaio for preparada, os pesquisadores adicionarão o componente ativador final à mistura para iniciar o ensaio de atividade. O pré-tratamento da enzima por meio do armazenamento da enzima em temperaturas baixas e, muitas vezes, a inclusão de vários aditivos químicos ou proteicos são fatores essenciais para garantir a estabilidade da enzima e a atividade máxima antes do início do ensaio. Depois que os materiais da reação forem combinados em um recipiente de observação, todos os componentes devem ser rápida e completamente misturados quando a reação começar. O registro de dados deve começar imediatamente após a mistura, e o sinal detectável do ensaio deve ser traçado para o curso completo do tempo da reação.
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