Eletroforese em gel

Existem vários métodos de eletroforese de proteínas em gel, com cada método fornecendo informações distintas sobre as proteínas de interesse:

SDS-PAGE

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecilsulfato de sódio (SDS) possibilita a separação de proteínas com base em suas massas moleculares. Neste método, o detergente SDS é incorporado ao tampão de corrida. O SDS confere uma carga negativa líquida às proteínas, mascarando sua carga intrínseca. À medida que as proteínas são separadas na presença de SDS e reagentes desnaturantes, elas se tornam menos globulares e mais lineares. Como resultado, a velocidade na qual as proteínas ligadas ao SDS migram através do gel depende principalmente de seu tamanho, permitindo estimar o peso da molécula comparando-a a padrões de proteínas.

PAGE nativa

Na eletroforese em gel de poliacrilamida nativa, as proteínas são separadas de forma a preservar sua conformação nativa (estrutura terciária), as interações entre as subunidades (estrutura quaternária e interações entre proteínas) e sua atividade biológica. Neste método, as proteínas são preparadas e corridas em condições não redutoras e não desnaturantes. A mobilidade da proteína é determinada por uma combinação complexa de fatores, pois cada proteína pode migrar para qualquer um dos eletrodos, dependendo de sua carga, e a uma velocidade dependente do seu formato e comportamento de ligação. Por este motivo, a PAGE nativa não é recomendada para determinação do peso molecular. A PAGE nativa é tipicamente usada em aplicações que requerem purificação de proteína ativa ou detecção por um anticorpo que reconhece apenas a forma nativa da proteína.

Focalização isoelétrica (IEF)

A focalização isoelétrica usa um campo elétrico e um gradiente de pH para separar as proteínas pelos seus pontos isoelétricos (pI) nativos. À medida que as proteínas se movem através do gradiente de pH, sua carga líquida muda. Em um campo elétrico, cada proteína migra para o pH onde sua carga líquida é igual a zero (denominado como o ponto isoelétrico da proteína). Durante o processo de separação, as proteínas da amostra se acumulam, ou "se focam", em locais específicos e previsíveis no gel. A focalização isoelétrica é usada na identificação de proteínas provenientes de amostras complexas (por exemplo, de lisados de células e tecidos, plasma), análise de modificações após a tradução e separação de amostras para análise por espectrometria de massa.

PAGE 2D

A eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional permite a resolução de proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) intrínseco e massa. A separação por pI ocorre por focalização isoelétrica (IEF). A separação por massa ocorre por SDS-PAGE. A PAGE 2D proporciona melhor resolução para análise de proteínas, e é comumente usada em pesquisas em proteômica para separar de centenas a milhares de proteínas em um único gel.