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Eletroforese em gel

Eletroforese de proteínas em gel. Câmara de eletroforese em gel para correr géis de proteínas

A eletroforese de proteínas em gel é uma técnica comum usada para separar proteínas para purificação, caracterização e análise de expressão. Nesta abordagem, moléculas de proteínas carregadas são transportadas através de um gel por um campo elétrico. Sua mobilidade através do campo elétrico depende do tamanho, formato e carga da proteína.

Matrizes de gel de poliacrilamida ou agarose podem ser usadas na eletroforese de proteínas. Essas matrizes servem como uma peneira, permitindo que proteínas menores se desloquem mais rapidamente que as proteínas maiores. A agarose tem um tamanho de poro grande e pode ser usada para separar proteínas com raio maior que 5 a 10 nm, como grandes complexos proteicos. A poliacrilamida tem um tamanho de poro menor, podendo separar proteínas que variam em tamanho de 5 kDa a 2.000 kDa, e é mais comumente usada em eletroforese de proteínas.

Existem vários métodos de eletroforese de proteínas em gel, com cada método fornecendo informações distintas sobre as proteínas de interesse.


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SDS-PAGE

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecilsulfato de sódio (SDS) possibilita a separação de proteínas com base em suas massas moleculares. Neste método, o detergente SDS é incorporado ao tampão de corrida. O SDS confere uma carga negativa líquida às proteínas, mascarando sua carga intrínseca. À medida que as proteínas são separadas na presença de SDS e reagentes desnaturantes, elas se tornam menos globulares e mais lineares. Como resultado, a velocidade na qual as proteínas ligadas ao SDS migram através do gel depende principalmente de seu tamanho, permitindo estimar o peso da molécula comparando-a a padrões de proteínas.

PAGE nativa

Na eletroforese em gel de poliacrilamida nativa, as proteínas são separadas de forma a preservar sua conformação nativa (estrutura terciária), as interações entre as subunidades (estrutura quaternária e interações entre proteínas) e sua atividade biológica. Neste método, as proteínas são preparadas e corridas em condições não redutoras e não desnaturantes. A mobilidade da proteína é determinada por uma combinação complexa de fatores, pois cada proteína pode migrar para qualquer um dos eletrodos, dependendo de sua carga, e a uma velocidade dependente do seu formato e comportamento de ligação. Por este motivo, a PAGE nativa não é recomendada para determinação do peso molecular. A PAGE nativa é tipicamente usada em aplicações que requerem purificação de proteína ativa ou detecção por um anticorpo que reconhece apenas a forma nativa da proteína.

Focalização isoelétrica (IEF)

A focalização isoelétrica usa um campo elétrico e um gradiente de pH para separar as proteínas pelos seus pontos isoelétricos (pI) nativos. À medida que as proteínas se movem através do gradiente de pH, sua carga líquida muda. Em um campo elétrico, cada proteína migra para o pH onde sua carga líquida é igual a zero (denominado como o ponto isoelétrico da proteína). Durante o processo de separação, as proteínas da amostra se acumulam, ou "se focam", em locais específicos e previsíveis no gel. A focalização isoelétrica é usada na identificação de proteínas provenientes de amostras complexas (por exemplo, de lisados de células e tecidos, plasma), análise de modificações após a tradução e separação de amostras para análise por espectrometria de massa.

PAGE 2D

A eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional permite a resolução de proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) intrínseco e massa. A separação por pI ocorre por focalização isoelétrica (IEF). A separação por massa ocorre por SDS-PAGE. A PAGE 2D proporciona melhor resolução para análise de proteínas, e é comumente usada em pesquisas em proteômica para separar de centenas a milhares de proteínas em um único gel.




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