Lise e extração de proteínas

Existem vários métodos disponíveis para romper células e preparar seu conteúdo para análise. Em geral, os métodos suaves são empregados quando a amostra consiste em células cultivadas ou células sanguíneas facilmente lisadas, enquanto os métodos mais vigorosos são empregados para o rompimento de células bacterianas ou vegetais mais robustas, ou células de mamíferos incorporadas ao tecido conjuntivo.

• Lise baseada em detergente: Lise baseada em detergente: A lise com detergente é um método suave que pode ser usado para células de mamíferos, células bacterianas, leveduras e plantas. As suspensões celulares são centrifugadas suavemente e ressuspendidas em solução de lise contendo detergentes que atuam para romper a membrana celular. As membranas são solubilizadas, lisando as células e liberando seu conteúdo. Os detergentes podem precisar ser removidos a jusante se interferirem na análise ou na produção.
• Lise por congelamento e descongelamento: Este método é aplicável a suspensões de células bacterianas ou de mamíferos. A suspensão de células é rapidamente congelada com nitrogênio líquido. Em seguida, a amostra é descongelada e ressuspendida por pipetagem ou vórtex suave no tampão de lise, repetindo o processo várias vezes. Entre os ciclos, a amostra é centrifugada e o sobrenadante que contém a proteína solúvel é retido.
• Choque osmótico: Esse é um método muito suave que pode ser suficiente para a lise de células bacterianas ou de mamíferos em suspensão sem o uso de detergente. O método, muitas vezes combinado com a ruptura mecânica, depende da mudança de um meio osmótico alto para um baixo e é adequado para aplicações em que o lisado deve ser posteriormente fracionado em componentes subcelulares.
• Ultrassonicação: Esse método de extração de proteínas é aplicado com mais frequência a suspensões de células. As células são rompidas por ondas sonoras de alta frequência por meio de uma sonda inserida na amostra. As ondas sonoras geram uma região de baixa pressão, causando o rompimento das membranas celulares.
• Métodos mecânicos: As proteínas podem ser extraídas de células e tecidos usando várias medidas brutas, mas eficazes, de "trituração e moagem". Por exemplo, as membranas celulares podem ser rompidas por forças de cisalhamento de líquidos usando a homogeneização Dounce ou Potter-Elvehjem. Os tecidos podem ser homogeneizados por corte ou trituração em tampão refrigerado usando um liquidificador Waring ou um homogeneizador Polytron® . Os tecidos ou as células podem ser congelados em nitrogênio líquido e moídos até virar um pó fino usando um almofariz e pilão com alumina ou areia. A agitação rápida das células com contas de vidro finas rompe as paredes celulares, sendo eficaz para a maioria das bactérias Gram positivas e Gram negativas.
• Digestão enzimática: Digestão enzimática: Os métodos enzimáticos são usados com frequência na extração de proteínas de bactérias, leveduras ou células eucarióticas incorporadas em tecidos fibrosos, onde as membranas celulares são cercadas por uma estrutura protetora robusta. Enzimas ou coquetéis de lise celular, como lisozima, mutanolisina, metapolimina, lisonase e pronase, podem ser usados em combinação com enzimas de digestão de tecidos (ou seja, colagenase, condroitinase, hialoronidase) para dissolver ou romper paredes celulares, revestimentos, cápsulas, cápsides ou outras estruturas que não são facilmente cortadas apenas por métodos mecânicos. A digestão enzimática pode ser seguida por homogeneização, sonicação ou vórtex vigoroso em um tampão de lise.

Além disso, como as proteases e fosfatases endógenas podem ser liberadas após o rompimento da célula e degradar a molécula alvo, a amostra deve ser protegida durante o rompimento da célula e a purificação subsequente usando inibidores de protease e fosfatase para evitar a perda descontrolada do alvo.