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Espectrometria de massa de proteínas

Espectrometria de massa de proteínas para identificação, caracterização e quantificação de proteínas

A espectrometria de massa de proteínas é amplamente usada para analisar amostras biológicas para descoberta de biomarcadores, em pesquisa proteômica e aplicações clínicas. Em comparação com outras técnicas utilizadas para a caracterização de proteínas em larga escala, a espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta essencial para a proteômica devido à sua adequação a análises complexas.

A espectrometria de massa é usada para identificar e caracterizar quantitativamente proteínas com base em sua estrutura, modificações pós-traducionais e interações.

  • A identificação de proteínas normalmente envolve digestão química ou enzimática de proteínas em peptídeos, que são então analisados por espectrometria de massa e identificados utilizando métodos computacionais ou sequenciamento.
  • As modificações pós-traducionais podem ser identificadas através de alterações na massa dos resíduos de aminoácidos. Os sítios de modificação podem ser mapeados usando métodos de sequenciamento ou computacionais.
  • Para a análise e determinação do perfil de glicanos, métodos enzimáticos ou químicos são usados para liberar porções de glicano das glicoproteínas, seguido de derivatização dos glicanos liberados para análise por espectrometria de massa.
  • As interações proteicas são determinadas por copurificação por afinidade de uma proteína-alvo específica com quaisquer proteínas que estejam interagindo com ela ou são estudadas de forma geral, usando cromatografia de exclusão por tamanho ou de troca iônica antes da análise por espectrometria de massa.

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Para a proteômica quantitativa, as proteínas ou peptídeos podem ser marcados quimicamente com isótopos estáveis, usando marcação de massa em tandem (TMT) e iTRAQ, ou metabolicamente, por meio da incorporação de aminoácidos marcados (SILAC). A comparação da incorporação de isótopos pesados e leves permite a quantificação relativa por meio da correlação das intensidades dos picos de espectro de massa com as abundâncias de proteínas. Para quantificação absoluta, as amostras podem ser enriquecidas com padrões de peptídeos ou proteínas sintéticos isotopicamente marcados para fins de análise do monitoramento da reação selecionada (SRM, do inglês selected reaction monitoring).

Na espectrometria de massa de proteínas, as massas de diferentes proteínas e peptídeos são determinadas medindo a razão m/z (massa/carga) de seus íons em fase gasosa. Os espectrômetros de massa primeiro convertem moléculas de proteína em íons em fase gasosa usando uma fonte de íons. Em seguida, um analisador de massa separa os analitos ionizados com base na razão m/z. Em seguida, um detector registra o número de íons em cada valor de m/z. Ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) e ionização por eletrospray (ESI) são comumente usadas para ionizar peptídeos ou proteínas.

Espectrometria de massa com MALDI-TOF

A ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) é um método de ionização que usa uma matriz que absorve energia de um laser para gerar íons com fragmentação mínima das moléculas de proteínas. Primeiramente, a amostra é misturada com um material de matriz adequado. Em seguida, um laser pulsado irradia a amostra, desencadeando a ablação e dessorção da amostra e do material de matriz. As moléculas de analito são, em seguida, ionizadas por protonação ou desprotonação nos gases ablacionados antes da análise por espectrometria de massa.

Espectrometria de massa com ionização por eletrospray

A ionização por eletrospray (ESI) produz íons usando um eletrospray no qual uma alta tensão é aplicada à amostra líquida para criar um aerossol, gerando íons com fragmentação mínima de peptídeos e proteínas. A ionização por eletrospray é comumente usada quando se usa espectrometria de massa em conjunto com cromatografia líquida (LC-MS), pois o eluato da cromatografia líquida pode ser alimentado diretamente a um eletrospray para processamento em tandem.


Fluxo de trabalho

Preparo de amostras para análise de proteínas por espectrometria de massa

Preparo de amostras proteicas

O preparo da amostra proteica para espectrometria de massa requer a lise celular ou a solubilização e estabilização das proteínas. Para análise proteômica, as células são lisadas usando tampões que quebram a membrana celular com inibidores de protease para impedir a degradação das proteínas. Proteínas altamente abundantes são removidas, conforme necessário. A recuperação e o enriquecimento das frações selecionadas facilitam a análise proteômica.

Proteólise específica para determinados sítios de amostras para espectrometria de massa de proteínas

As proteases específicas para determinados sítios, como a tripsina, são usadas para clivar proteínas em pequenos fragmentos para permitir a identificação por meio da combinação de espectros experimentais com espectros teóricos de bancos de dados de proteínas, ou comparando com os padrões de corrida. Para fins de quantificação relativa, as culturas celulares podem ser metabolicamente marcadas usando isótopos estáveis, incorporados através da inserção de aminoácidos, ou as amostras podem ser marcadas com isótopos estáveis usando métodos químicos. As amostras enriquecidas com peptídeos sintéticos marcados com isótopos viabilizam a quantificação absoluta através da análise do monitoramento da reação selecionada (SRM).

Uso de calibradores e padrões para espectrometria de massa de proteínas

Os padrões de calibração podem servir como controles para análise de amostras e podem ser usados para determinar a identidade da proteína, a sensibilidade do experimento, a eficiência de digestão e auxiliar na separação cromatográfica e análise quantitativa.

Uso de cromatografia em tandem em espectrometria de massa de proteínas

A cromatografia possibilita a separação de proteínas e peptídeos em amostras mais fáceis de trabalhar para análise. Como vários peptídeos distintos podem ter massas semelhantes, a HPLC é comumente usada para evitar a adição simultânea de peptídeos com massas muito semelhantes ou idênticas ao espectrômetro de massa, aumentando o intervalo dinâmico total das medições.

Detecção e análise de proteínas em fluxos de trabalho de espectrometria de massa

Proteínas e peptídeos são ionizados por MALDI ou ESI antes da detecção e análise. Um analisador de massa identifica os íons com base em seus valores de m/z. Os padrões de fragmentação resultantes podem ser usados para identificação, e as amostras podem ser quantificadas relativamente avaliando as razões de intensidade dos picos das amostras diferenciadas pela marcação isotópica, ou quantificadas de modo absoluto usando a análise de SRM com padrões internos marcados.




Destaques

ISOTEC®
ISOTEC®

Primer para marcação isotópica estável por aminoácidos em cultura celular (SILAC)

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Ferramentas para espectrometria de massa
Ferramentas para espectrometria de massa

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa e ferramentas para monitorar proteínas por espectrometria de massa

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