Técnicas de “pull-down” de proteínas

Aplicações de afinidade por pull-down com GST

A glutationa S-transferase (GST) é uma proteína de 211 aminoácidos que é encontrada na maioria dos organismos. A GST é frequentemente integrada nos vetores de expressão para produzir a cauda de fusão dentro dos sistemas de expressão de proteínas de E. coli. A cauda de GST é uma cauda proteica grande de aproximadamente 26 kDa, e pode ser expressa em células de bactérias, leveduras, mamíferos e insetos. A cauda de GST é vantajosa quando é necessário proteger a proteína recombinante da clivagem da protease intracelular, e quando há a necessidade de aumentar a solubilidade da proteína marcada. Além disso, a proteína GST fornece uma cauda de alta afinidade para fácil purificação e para experimentos de pull-down utilizando resinas de afinidade baratas que são realizadas em condições brandas de diluição.

Coimunoprecipitação

O ensaio de pull-down é ideal para verificar os resultados da coimunoprecipitação e um excelente método de identificação de interações proteicas desconhecidas, bem como do status de ativação de proteínas específicas. Diferentemente dos métodos de afinidade por pull-down, a IP utiliza anticorpos para se ligar e isolar antígenos de amostras biológicas complexas. 

A Co-IP refere-se ao uso de um anticorpo para ligar um antígeno dentro de um complexo multiproteico. O complexo é, em seguida, capturado com a adição de meio de proteína A ou proteína G. A alta afinidade das proteínas A/G com a região Fc de anticorpos do tipo IgG policlonais e monoclonais faz delas um componente crítico na purificação da proteína ou do complexo proteico de interesse. O uso de métodos de pull-down de proteínas é uma ferramenta essencial para investigar as redes de interações proteicas; no entanto, a escolha do método específico será determinada pela necessidade específica da aplicação do pesquisador.