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Purificação de proteínas

Purificação de proteínas

Vários métodos de purificação de proteínas são amplamente utilizados na pesquisa biológica e biomédica. Os fluxos de trabalho de expressão e purificação de proteínas recombinantes dependem de muitas variáveis. Essas variáveis incluem, mas não se limitam às propriedades físicas e à função biológica da proteína, e se uma linhagem de células bacterianas ou eucarióticas deve ser usada para expressar a proteína de interesse. Avanços significativos foram feitos na área de expressão de proteínas recombinantes e metodologia de purificação, além de uma infinidade de sistemas e kits disponíveis comercialmente. No entanto, as proteínas são macromoléculas complexas, e estratégias otimizadas de expressão e purificação de proteínas devem ser determinadas de forma empírica.


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Fatores críticos para a purificação de proteínas

A estrutura e a função das proteínas são, com frequência, fatores críticos a serem considerados ao selecionar uma estratégia de purificação de proteínas. A atividade bioquímica ou biológica da proteína recombinante é parcialmente determinada por domínios discretos dentro da proteína, os quais muitas vezes dependem da proteína para sofrer enovelamento em estruturas secundárias, terciárias e quaternárias.

O enovelamento de proteínas é coletivamente chamado de estrutura de ordem superior (higher order structure (HOS)) e é essencial para a forma tridimensional e função corretas da proteína. Além disso, a solubilidade da proteína é um atributo altamente desejável para a purificação bem sucedida de proteínas e é influenciada por inúmeros fatores, incluindo o tamanho e os elementos nas terminações N e C. Proteínas recombinantes geralmente incorporam etiquetas nas terminações N e C, que são pequenas sequências usadas para detecção e purificação imuno-histoquímica, ou cromatografia por afinidade a proteínas, dependendo da etiqueta específica nas terminações N e C e da aplicação a jusante (downstream) pretendida.

Métodos e aplicações da purificação de proteínas

Quer os pesquisadores pretendam estudar a função proteica ou busquem aumentar a escala de purificação de proteínas usando estratégias para a produção de produtos biológicos e farmacêuticos em escala industrial a jusante (downstream), existem inúmeros métodos de purificação de proteínas, reagentes e ferramentas disponíveis. O método de purificação de proteínas selecionado determinará parcialmente o fluxo de trabalho de preparo da amostra. A cromatografia de afinidade é uma etapa inicial de purificação adequada para purificar proteínas recombinantes solubilizadas que contêm caudas relevantes; no entanto, proteínas indesejadas provavelmente também se ligam à coluna de resina de afinidade e são eluidas na lavagem final, juntamente com a proteína de interesse desejada. Se for necessária uma purificação adicional, estratégias de purificação suplementares podem ser empregadas, incluindo cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de troca iônica. É importante notar que, muitas caudas de afinidade podem ser removidas, pois os pesquisadores podem querer remover quaisquer sequências não nativas da proteína purificada final.




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