Western blot
O western blot é uma técnica analítica bem estabelecida para detectar, analisar e quantificar proteínas. Este método é amplamente utilizado para detectar moléculas de proteínas específicas em amostras complexas, como em homogenados de tecidos e lisados celulares. O western blot normalmente envolve a separação de proteínas por eletroforese em gel, seguida por transferência para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose. Após a transferência das proteínas, elas podem ser coradas para serem visualizadas e identificadas diretamente por sequenciamento N-terminal, espectrometria de massa ou imunodetecção.
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Na imunodetecção por western blot, as proteínas são identificadas por meio de sua ligação a anticorpos específicos. Tipicamente, um anticorpo primário é usado em combinação com um anticorpo secundário conjugado a HRP ou AP para detecção por quimiluminescência ou colorimetria usando um substrato apropriado. Alternativamente, um anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente pode ser usado para visualização direta.
A técnica de western blot é amplamente utilizada em bioquímica para detectar a presença de proteínas específicas, determinar a extensão das modificações pós-tradução, verificar a expressão proteica em aplicações de clonagem, analisar os níveis de expressão de proteínas e biomarcadores, no mapeamento de epítopos de anticorpos e para testar quanto à presença de marcadores de doenças em contextos clínicos.
A necessidade de analisar simultaneamente mais proteínas em amostras limitadas impulsionou pesquisas contínuas para melhorar a sensibilidade e a velocidade das técnicas de blot. A realização de blot duplo elimina os falsos positivos causados por interações inespecíficas. A técnica de far-western blot possibilita a detecção de interações proteicas específicas. A técnica de southwestern blot é usada para identificar proteínas que interagem com sequências específicas de DNA. A técnica de blot com várias tiras (multistrip) aumenta o rendimento ao mesmo tempo em que minimiza a variabilidade entre blots. Novas tecnologias estão sendo desenvolvidas para reduzir as quantidades de proteína necessárias para produzir um sinal e melhorar a capacidade quantitativa do western blot.
Fluxo de trabalho
Eletroforese em gel
A eletroforese de proteínas em gel é usada para separar e resolver proteínas antes da análise por técnicas de blot. A mistura de proteínas preparada é analisada em um gel de poliacrilamida para separar as proteínas de acordo com o seu peso molecular e carga.
Transferência para uma membrana
As proteínas separadas no gel por eletroforese são imobilizadas por transferência para uma membrana de PVDF ou nitrocelulose. A transferência usa corrente elétrica para “puxar” as proteínas do gel para a membrana (eletroblot).
Detecção
A proteína-alvo é detectada usando um anticorpo primário em combinação com um anticorpo secundário, conjugado a HRP ou AP, e um substrato quimiluminescente ou colorimétrico apropriado, ou usando anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente.
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