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Western blot

Laboratório de western blot. Técnica de western blot para detecção de proteínas

O western blot é uma técnica analítica bem estabelecida para detectar, analisar e quantificar proteínas. Este método é amplamente utilizado para detectar moléculas de proteínas específicas em amostras complexas, como em homogenados de tecidos e lisados celulares. O western blot normalmente envolve a separação de proteínas por eletroforese em gel, seguida por transferência para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose. Após a transferência das proteínas, elas podem ser coradas para serem visualizadas e identificadas diretamente por sequenciamento N-terminal, espectrometria de massa ou imunodetecção. 

Na imunodetecção por western blot, as proteínas são identificadas por meio de sua ligação a anticorpos específicos. Tipicamente, um anticorpo primário é usado em combinação com um anticorpo secundário conjugado a HRP ou AP para detecção por quimiluminescência ou colorimetria usando um substrato apropriado. Alternativamente, um anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente pode ser usado para visualização direta.


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A técnica de western blot é amplamente utilizada em bioquímica para detectar a presença de proteínas específicas, determinar a extensão das modificações pós-tradução, verificar a expressão proteica em aplicações de clonagem, analisar os níveis de expressão de proteínas e biomarcadores, no mapeamento de epítopos de anticorpos e para testar quanto à presença de marcadores de doenças em contextos clínicos.

A necessidade de analisar simultaneamente mais proteínas em amostras limitadas impulsionou pesquisas contínuas para melhorar a sensibilidade e a velocidade das técnicas de blot. A realização de blot duplo elimina os falsos positivos causados por interações inespecíficas. A técnica de far-western blot possibilita a detecção de interações proteicas específicas. A técnica de southwestern blot é usada para identificar proteínas que interagem com sequências específicas de DNA. A técnica de blot com várias tiras (multistrip) aumenta o rendimento ao mesmo tempo em que minimiza a variabilidade entre blots. Novas tecnologias estão sendo desenvolvidas para reduzir as quantidades de proteína necessárias para produzir um sinal e melhorar a capacidade quantitativa do western blot.


Fluxo de trabalho

Lise celular de proteínas para western blot.

Extração de proteínas

Quando se trabalha com células ou tecidos, as amostras devem ser rompidas para isolar as proteínas antes da análise. Os tampões de lise e de extração usam detergentes para romper paredes celulares e membranas para liberar as proteínas. O tampão ideal deve ser escolhido com base no tipo de amostra e na localização subcelular da proteína-alvo.

Câmara de eletroforese em gel para correr géis de proteínas.

A eletroforese de proteínas em gel é usada para separar e resolver proteínas antes da análise por técnicas de blot. A mistura de proteínas preparada é analisada em um gel de poliacrilamida para separar as proteínas de acordo com o seu peso molecular e carga.

Transferência de proteínas para a membrana de PVDF para detecção usando técnicas de western blot.

As proteínas separadas no gel por eletroforese são imobilizadas por transferência para uma membrana de PVDF ou nitrocelulose. A transferência usa corrente elétrica para “puxar” as proteínas do gel para a membrana (eletroblot).

Detecção por western blot da proteína-alvo usando um anticorpo primário e um anticorpo secundário conjugado a HRP com substrato.

A proteína-alvo é detectada usando um anticorpo primário em combinação com um anticorpo secundário, conjugado a HRP ou AP, e um substrato quimiluminescente ou colorimétrico apropriado, ou usando anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente.





Destaques

Protein Blotting Handbook
Protein Blotting Handbook

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