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Preparo de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS)

Preparo de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS)

O preparo de biblioteca é a primeira etapa do sequenciamento de próxima geração. Antes de as amostras de DNA e RNA poderem ser sequenciadas, os ácidos nucleicos precisam ser isolados, fragmentados, ter suas extremidades reparadas e serem ligados covalentemente a adaptadores por métodos de ligação ou marcação. A complexidade de uma biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) bem preparada deve refletir integral e precisamente a complexidade da amostra, mas também refletir qualquer viés introduzido durante o preparo da biblioteca. Um objetivo importante no preparo de bibliotecas de DNA ou RNA para sequenciamento de próxima geração é maximizar a complexidade e, ao mesmo tempo, reduzir o viés introduzido pela PCR ou outro viés introduzido pela amplificação, uma vez que a qualidade da biblioteca resultante pode afetar significativamente o resultados do NGS.

Oferecemos um portfólio de ferramentas para preparo de bibliotecas de NGS desenvolvido para simplificar os fluxos de trabalho e facilitar o preparo de bibliotecas de DNA ou RNA de alta qualidade que representem com precisão a complexidade das amostras e, ao mesmo tempo, reduza o viés para aplicações de sequenciamento de genoma completo (WGS), análise de transcriptoma completo (WTA), sequenciamento de RNA total e sequenciamento de miRNA e RNA pequeno.


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Kits de extração de DNA genômico

Para preparar bibliotecas de DNA, é preciso extrair de células, tecidos ou outros tipos de amostra DNA genômico (gDNA) de alto peso molecular. O DNA genômico purificado deve ter o mínimo possível de cisalhamento e de contaminantes biológicos e químicos para apresentar desempenho ideal em reações posteriores de amplificação ou sequenciamento.

O kit de extração de DNA de alto peso molecular Fire Monkey™/Fire Flower™ possibilita o isolamento de DNA genômico de alta pureza com cisalhamento mínimo e baixo teor de contaminantes de ácidos nucleicos de baixo peso molecular.

  • O Fire Monkey™ é um processo em coluna para centrífuga padrão que extrai DNA de alto peso molecular, com comprimentos médios de fita > 100 kb, de células bacterianas ou de mamíferos em 1 hora.
  • O Fire Flower™ é um processo em coluna para centrífuga padrão capaz de selecionar, de acordo com o tamanho, o DNA extraído de qualquer fonte de amostra em 15 minutos. O Fire Flower™ pode aumentar o comprimento médio geral da fita em 30% e, ao mesmo tempo, remover fragmentos de DNA de até 30 kb.

Kits de amplificação de genoma completo

Com frequência, a análise de sequência de DNA é limitada pela baixa quantidade de amostra disponível ou pelo baixo rendimento da extração. Quando a obtenção do material de partida é viável apenas em quantidades limitadas, podem ser usadas técnicas de amplificação para aumentar a quantidade de DNA de partida. A amplificação de genoma completo (WGA) pode ser usada para pré-amplificar tanto amostras de DNA intacto quanto de DNA altamente fragmentado para introdução em fluxos de trabalho de NGS.

O kit de WGA SeqPlex-I permite a amplificação de pequenas quantidades de DNA ou de DNA degradado ou altamente fragmentado para introdução direta nas células do fluxo de sequenciamento de próxima geração (NGS) Illumina®.

  • Facilita o sequenciamento a partir de quantidades mínimas a partir de 100 pg de DNA
  • Primers aperfeiçoados para cobertura genômica completa, mínimo viés de sequência e tamanho de amplicon ideal para sequenciamento de próxima geração (NGS)
  • Econômico: Ausência de etapa adicional de preparo de bibliotecas para NGS
  • Compatível com sequenciamento de próxima geração Illumina®

O kit de amplificação de DNA aprimorado SeqPlex para amplificação de genoma completo foi projetado para facilitar o sequenciamento de próxima geração a partir de quantidades extremamente pequenas ou de DNA degradado/altamente fragmentado. Este kit foi desenvolvido para ser integrado nos fluxos de trabalho de sequenciamento Illumina®, SOLiD™ ou 454.

  • Tecnologia de priming aleatório amplifica DNA fragmentado, como ChIP (imunoprecipitação da cromatina) ou FFPE (fixado em formalina e embebido em parafina)
  • Facilita o sequenciamento a partir de quantidades mínimas a partir de 100 pg de DNA por ChiP
  • Primers aperfeiçoados para cobertura genômica completa, mínimo viés de sequência e remoção de primers
  • Compatível com preparo de bibliotecas Illumina®, SOLiD™ ou 454 para sequenciamento de próxima geração

Kits de amplificação de transcriptoma completo

O principal objetivo no preparo de uma biblioteca de NGS para sequenciamento de RNA é maximizar a complexidade da biblioteca de transcriptomas para representar integralmente o agregado inicial de sequências e, ao mesmo tempo, reduzir o viés. O sequenciamento de DNA para determinação de perfil de expressão gênica de alto rendimento e análise de transcriptoma é, em geral, complexo devido às baixas quantidades de RNA inicial. A amplificação de transcriptoma completo (WTA) pode ser usada para gerar quantidades suficientes de alvos de sequenciamento a partir de pequenas quantidades de RNA, mas requer replicação de transcritos de alta fidelidade, sem perda ou distorção de mRNAs específicos para reduzir o viés da biblioteca.

O kit de WTA SeqPlex-I permite a amplificação de pequenas quantidades de RNA resultante de transcrição reversa ou de RNA degradado para introdução direta nas células de fluxo de sequenciamento de próxima geração (NGS) Illumina®.

  • Amplifica RNA fragmentado ou quantidades muito pequenas de RNA total. RNA fragmentado ou intacto de todas as fontes, inclusive FFPE e RIP, é facilmente amplificado usando tecnologia de priming aleatório.
  • O design de primers semidegenerados para bibliotecas garante cobertura mais completa do transcriptoma e priming mais eficiente
  • Menos etapas: Não é preciso fragmentar o cDNA antes do sequenciamento
  • Alta eficiência: Amplifica ds-cDNA em 8 horas ou menos
  • Econômico: Não é mais necessária uma etapa adicional para preparo de bibliotecas para NGS
  • Compatível com sequenciamento de próxima geração Illumina®

O kit de amplificação de RNA SeqPlex para amplificação de transcriptoma completo (WTA) foi projetado para facilitar o sequenciamento de próxima geração (NGS) a partir de quantidades pequenas de RNA ou de RNA degradado/altamente fragmentado (p. ex., RNA de amostras de tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFPE)). O kit SeqPlex permite que o usuário pré-amplifique amostras de RNA para introdução nos fluxos de trabalho de NGS.

  • A tecnologia de priming aleatório amplifica quantidades pequenas de RNA fragmentado ou intacto de todas as fontes, inclusive FFPE e RIP.
  • Design de primers semidegenerados para bibliotecas para uma cobertura mais completa do transcriptoma e priming mais eficiente.
  • Não é preciso fragmentar o DNA antes do sequenciamento.
  • Amplifica ds-cDNA em 8 horas ou menos.
  • Compatível com todas as plataformas de sequenciamento de próxima geração, exceto da Pacific Bioscience.

Preparo de bibliotecas de RNA pequeno

As tecnologias de NGS revolucionaram o estudo de RNAs pequenos, incluindo miRNA, siRNA e piRNA, que demonstraram desempenhar um papel essencial na regulação pós-tradução da expressão gênica. O sequenciamento de RNA pequeno tornou-se uma abordagem cada vez mais popular na descoberta e determinação do perfil de RNAs pequenos. No entanto, os métodos de preparo de bibliotecas de RNA pequeno podem introduzir viés significativo, especificamente durante as etapas de ligação a adaptadores.

O kit de preparo de bibliotecas de RNA RealSeq®-AC oferece um método inovador para de preparo de bibliotecas de sequenciamento de miRNA e RNA pequeno que diminui o viés de incorporação no NGS. O uso de um novo sistema de adaptador único e circularização, o RealSeq® reduz consideravelmente o viés no preparo de bibliotecas. Esta tecnologia resolve o problema de preparos de bibliotecas de sequenciamento comumente usados que levam à subdetecção de muitos miRNAs.

  • Reduz significativamente o viés no sequenciamento de RNAs pequenos
  • Quantifica de forma precisa RNAs pequenos biologicamente relevantes
  • Permite a descoberta mais eficiente de novos RNAs pequenos

Limpeza de bibliotecas

A limpeza de bibliotecas de NGS envolve a remoção de adaptadores de sequenciamento, primers de PCR, dNTPs, enzimas e contaminantes de tampão, enquanto permite a seleção de ácidos nucleicos que estão na faixa de tamanho correta para sequenciamento a jusante (downstream). Métodos de limpeza de bibliotecas devem maximizar o rendimento e a recuperação, minimizar a presença de contaminantes biológicos e químicos e remover fragmentos de ácidos nucleicos ou moléculas de biblioteca indesejados no preparo para o sequenciamento.

O sistema de limpeza de PCR HighPrep™ é um reagente de limpeza pós-PCR à base de esferas paramagnéticas projetado para purificação eficiente de fragmentos de DNA e para seleção de amplicons de tamanho específico. A purificação consiste na remoção de sais, primers, dímeros de primers, dNTPs, uma vez que os fragmentos de DNA se ligam seletivamente às partículas esféricas magnéticas. As esferas magnéticas são usadas para diferentes compostos químicos para o preparo de biblioteca para NGS.

  • Alta recuperação de amplicons > 100 bp
  • Adaptável a sistemas de manuseio de líquidos de alto rendimento
  • Recuperação estável de amplicons > 100 bp, seleção de tamanho previsível e consistente
  • A ausência de centrifugação e filtração leva a rendimentos maiores e maior pureza

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