Reagentes e substratos de imunodetecção
No Western blotting, o fator mais importante para determinar o sucesso dos experimentos é a qualidade dos reagentes usados. Oferecemos uma série de reagentes para Western blotting que são pré-otimizados para trabalhar em sinergia, fornecendo sinais específicos fortes e baixo fundo para ajudá-lo a produzir rapidamente resultados com qualidade de publicação.
Produtos
Reagentes de bloqueio
O bloqueio de locais de membrana não ligados evita a ligação não específica de anticorpos que pode levar a um alto nível de fundo. Os bloqueadores tradicionais à base de leite, gelatina e outras proteínas são eficazes para muitas aplicações de blotting, mas podem reduzir a sensibilidade ou a detecção mascarando o sinal ou interferindo na detecção de alvos proteicos específicos. Immobilon® Block Noise Cancelling Reagents incluem tampões prontos para uso, livres de proteínas, otimizados para reduzir os níveis de fundo ao usar detecção por quimioluminescência, fluorescente ou fosfoproteína.
Guia de Seleção de Reagentes de Bloqueio de Western Blot | |||||
|---|---|---|---|---|---|
Se você quiser... | Use... | Para blots quimioluminescentes | Para Blots Colorimétricos | Para Blots Fluorescentes | Fornecido como |
Para amplificar o sinal de seu anticorpo com proteína de origem vegetal | Immobilon Signal Enhancer (WBSH0500) | Sim | Sim | Sim | Pronto para uso |
Um bloqueador sem proteína otimizado para detecção quimioluminescente | Immobilon Block-CH (WBAVDCH01) | Melhor | Sim | Não | Pronto para usar |
Um bloqueador livre de proteínas otimizado para detecção fluorescente | Immobilon Block-FL (WBAVDFL01) | .Não | Não | Melhor | Pronto para uso |
Um bloqueador livre de proteínas otimizado para detecção de fosfoproteínas | Immobilon Block-PO (WBAVDP001) | Sim | Sim | Sim | Pronto para uso |
Um reagente de bloqueio com proteínas de não mamíferos | Reagente de bloqueio aquático, plasma de salmão (558300) | Sim | Sim | Não | Pronto para usar |
Um reagente de bloqueio otimizado para conjugados de HRP | Solução Western Blocker (W0138) | Sim | Sim | Não | Pronto para uso |
Quantidade a granel de leite seco desnatado | Reagente de bloqueio imunoblot (20-200) | Sim | Sim | Não | Pó a granel |
Leite seco sem gordura pré-tampado | Solução salina tamponada com fosfato com 5% de leite seco desnatado (P4739) | Sim | Sim | Não | Pó pré-distribuído |
Para personalizar a concentração de bloqueio para | Caseína solúvel em álcali a 5% (70955) | Sim | Sim | Sim | Solução concentrada |
Bloqueio sem proteínas otimizado para sistemas de detecção de avidina-biotina | ChemiBLOCKER (2170) | Sim | Sim | Não | Solução concentrada |
Bloqueia amostras de proteínas e ácidos nucleicos em nitrocelulose ou membranas de náilon | Tampão de bloqueio de gelatina (G7663) | Sim | Sim | Sim | Pó a granel |
Streptavidin and Secondary Antibody Conjugates
Os métodos modernos de imunodetecção baseiam-se na detecção ligada a enzimas usando estreptavidina ou anticorpos secundários ligados covalentemente a enzimas, como a peroxidase de rábano (HRP) ou a fosfatase alcalina (AP). A enzima conjugada catalisa a degradação de substratos específicos, resultando na geração de sinal. Uma variedade de conjugados de estreptavidina, Proteína A, Proteína G e anticorpo secundário está disponível para Western blotting. Também oferecemos uma ampla seleção de substratos HRP e AP para detecção quimioluminescente, cromogênica e quimifluorescente em Western blotting.
SUBSTRATOS QUIMILUMINESCENTES PARA BLOTTING OESTE
Immobilon® HRP para detecção quimioluminescente proporcionam maior sensibilidade para blots mais quantitativos, reduzindo os custos ao permitir que você diminua a concentração do anticorpo usado para detecção.Escolha entre um portfólio de substratos Immobilon® com sensibilidades variadas em formatos convenientes prontos para uso ou de dois componentes para otimizar a detecção para sua aplicação de Western blotting.
- Os substratos quimioluminescentes Immobilon® Classico, Crescendo e Fortecompreendem uma família de reagentes pré-misturados, prontos para uso, para detecção baseada em peroxidase, oferecidos em uma gama de sensibilidades para fornecer proporções ideais de sinal para fundo em um espectro de concentrações de proteínas-alvo. Limites de detecção:
- Immobilon® Classico: ~ 6 pg de proteína-alvo
- Immobilon® Crescendo: ~ 1-3 pg de proteína alvo
- Immobilon® Forte: ~ 400 fg proteína-alvo
- Immobilon® Western HRP, Immobilon® ECL Ultra e os substratos Immobilon® UltraPlus Western oferecem sensibilidade excepcional e longa vida útil do sinal em formatos padrão de dois componentes. Essas formulações permitem o uso de soluções mais diluídas de anticorpos primários para detecção em immunoblot. Limites de detecção:
- Substrato Western HRP Immobilon®: ~ 400 fg de proteína-alvo
- Substrato Immobilon® ECL Ultra: faixa baixa de femtogramas
- Substrato Immobilon® ECL UltraPlus Western Blot HRP: baixa faixa de femtogramas
Sensibilidade relativa dos substratos HRP quimioluminescentes Immobilon®
Figura 1.Uma série de diluições de duas vezes do lisado de células A431 [12-110], começando com 4 μg de proteína, foi executada em géis mPAGE® a 10% [MP10W15] em tampão MOPS [MPM0PS] a 200 V por 25 minutos. A proteína foi transferida para a membrana Immobilon®-P [IPVH00010] por 1 hora em tampão de transferência mPAGE® [MPTRB] com 10% de etanol. A imunodetecção da proteína HH3 (15 kDa) foi realizada com anticorpos anti-HH3 [H0164] de coelho e anti-coelho de cabra [AP132P] nas diluições listadas. Os blots foram incubados com os reagentes ECL indicados por 5 minutos e as imagens foram tiradas com uma exposição de 30 segundos no sistema Bio-Rad ChemiDoc.
Os reagentes de detecção Cytiva™ Amersham™ ECL usam detecção aprimorada baseada em luminol HRP com diferentes formulações disponíveis para cobrir diferentes necessidades de aplicação de Western blotting.
- Os reagentes de detecção ECL Western blotting da Cytiva Amersham™ são recomendados para aplicações confirmatórias de Western blotting.
- O reagente de detecção de Western blotting Cytiva Amersham™ ECL Prime permite a detecção de proteínas de alta e baixa abundância no mesmo blot.
- Os reagentes de detecção de Western blotting Cytiva Amersham™ ECL Select oferecem alta sensibilidade mesmo quando se usam anticorpos primários e secundários diluídos.
- O reagente de detecção de Western Blotting Cytiva Amersham™ ECL Start foi desenvolvido para detecção quimioluminescente de proteínas de média e alta expressão.
SUBSTRATOS CROMOGÊNICOS PARA BLOTTING WESTERN
A detecção cromogênica utiliza uma peroxidase (por exemplo, HRP) ou uma enzima conjugada com fosfatase alcalina (AP) para catalisar uma reação que resulta na deposição de um precipitado colorido insolúvel para detecção, Nossos substratos cromogênicos para Western blotting estão disponíveis em forma de solução, pó e comprimido para oferecer opções flexíveis de armazenamento e uso.
- SIGMAFAST™ DAB Tablets (substrato cromogênico de HRP)são compostos por um substrato precipitante colorimétrico que produz uma cor marrom ao reagir com a peroxidase de rábano e pode ser dissolvido em água para preparar uma solução tamponada pronta para uso para detecção de blotting.
- BCIP/NBT (azul/roxo) e BCIP/TNBT (azul/marrom) Single Reagent (substratos cromogênicos AP) são substratos colorimétricos altamente sensíveis para fosfatase alcalina.
- TMB Enhanced One Component HRP Membrane Substrate (substrato cromogênico de HRP) é um substrato colorimétrico de componente único que produz um produto azul escuro.
Substrato | Cor | Enzima | Sensibilidade |
|---|---|---|---|
BCIP/NBT | Azul/púrpura | AP | Alta |
Fast Red TR (4-Chloro-2-methylbenzenediazonium) | Vermelho/laranja | AP | Alto |
DAB (3,3'-Diaminobenzidina) | Castanho | HRP | Médio |
TMB (3,3′,5,5'-tetrametilbenzidina) | Azul escuro | HRP | Alta |
CN (4-cloro-1-naftol) | Azul/púrpura | HRP | Baixo |
Aprimoradores de sinal
- Immobilon® Signal Enhancer foi projetado para uso em aplicações de Western blotting quando for observada baixa intensidade de sinal. O aprimoramento da reação anticorpo-antígeno pode produzir um aumento de 2 a 10 vezes na intensidade do sinal. O Immobilon® Signal Enhancer é compatível com membranas de PVDF e nitrocelulose e pode ser usado com métodos de detecção cromogênicos, quimioluminescentes e fluorescentes.
- O SignalBoost™ Immunoreaction Enhancer Kit foi projetado para melhorar o sinal alvo quimioluminescente ou colorimétrico em membranas de nitrocelulose ou PVDF
Reagentes e kits para stripping e re-probing
Os reagentes para stripping e re-probing são especialmente formulados para remover rápida e efetivamente os anticorpos dos Western blots sem afetar significativamente as proteínas imobilizadas.
- Os reagentes ReBlot™ Plus removem com eficiência os anticorpos ligados aos blots com sonda. Os reagentes ReBlot™ Plus estão disponíveis em formulações leves e fortes.
Recursos relacionados
- Handbook: Protein Blotting Tips and Tricks
This handbook represents the collective experience of our application scientists, who are actively engaged in advancing the science of protein blotting and detection.
- Brochure: Rethink Western Blotting
Explore our products designed to improve each step of the Western blotting workflow.
- Article: Western Blotting Protocol (Immunoblotting Protocol)
Western blot protocol with workflow steps for different blot procedures, describing the electrophoretic transfer of proteins from SDS polyacrylamide gels to sheets of nitrocellulose.
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