Reagentes e substratos para imunodetecção
Em western blot, o fator mais importante na determinação do sucesso dos experimentos é a qualidade dos reagentes utilizados. Oferecemos uma variedade de reagentes para western blot que são pré-otimizados para atuar sinergicamente, fornecendo sinais específicos fortes e baixa interferência para ajudar você a produzir rapidamente resultados de qualidade adequada para publicação.
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This handbook represents the collective experience of our application scientists, who are actively engaged in advancing the science of protein blotting and detection.
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- Article: Western Blotting Protocol (Immunoblotting Protocol)
Western blot protocol with workflow steps for different blot procedures, describing the electrophoretic transfer of proteins from SDS polyacrylamide gels to sheets of nitrocellulose.
Reagentes bloqueadores
O bloqueio de sítios de membrana não ligados impede a ligação não específica de anticorpos que pode causar altos níveis de interferência. O leite comum, a gelatina e outros bloqueadores à base de proteínas são eficazes em muitas aplicações de blot, mas podem reduzir a sensibilidade ou a detecção mascarando o sinal ou interferindo na detecção de alvos proteicos específicos. Os reagentes de eliminação de interferências Immobilon®Block incluem tampões isentos de proteínas e prontos para uso, otimizados para reduzir os níveis de interferência na detecção por quimioluminescência, fluorescência ou com fosfoproteínas.
Guia de seleção de reagentes bloqueadores de western blot | |||||
|---|---|---|---|---|---|
Se você quiser... | Usar.... | Para manchas quimioluminescentes | Para blots colorimétricos | Para blots fluorescentes | Fornecido como |
Para amplificar o sinal do seu anticorpo com proteína vegetal | Intensificador de sinal Immobilon (WBSH0500) | Sim | Sim | Sim | Pronto para uso |
Um bloqueador sem proteínas otimizado para detecção quimioluminescente | Immobilon Block-CH (WBAVDCH01) | Melhor | Sim | Não | Pronto para uso |
Um bloqueador sem proteínas otimizado para detecção fluorescente | Immobilon Block-FL (WBAVDFL01) | Não | Não | Melhor | Pronto para uso |
Um bloqueador sem proteínas otimizado para detecção de fosfoproteínas | Immobilon Block-PO (WBAVDP001) | Sim | Sim | Sim | Pronto para uso |
Um reagente bloqueador com proteínas não derivadas de mamíferos | Reagente bloqueador aquático, plasma de salmão (558300) | Sim | Sim | Não | Pronto para uso |
Um reagente bloqueador otimizado para conjugados HRP | Solução bloqueadora para western blot (W0138) | Sim | Sim | Não | Pronto para uso |
Quantidade a granel de leite em pó desnatado | Reagente bloqueador de imunoblot (20-200) | Sim | Sim | Não | Pó a granel |
Leite em pó desnatado pré-tamponado | Solução salina tamponada com fosfato com 5% de leite em pó desnatado (P4739) | Sim | Sim | Não | Pó pré-repartido |
Para personalizar a concentração de bloqueio para | 5% de caseína solúvel em álcalis (70955) | Sim | Sim | Sim | Solução concentrada |
Bloqueio sem proteínas otimizado para sistemas de detecção de avidina-biotina | ChemiBLOCKER (2170) | Sim | Sim | Não | Solução concentrada |
Bloqueie amostras de proteínas e ácidos nucleicos em membranas de nitrocelulose ou náilon | Tampão bloqueador de gelatina (G7663) | Sim | Sim | Sim | Pó a granel |
Conjugados de estreptavidina e anticorpo secundário
Os métodos modernos de imunodetecção baseiam-se na detecção enzimática usando estreptavidina ou anticorpos secundários ligados de modo covalente a enzimas, como a peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (FA). A enzima conjugada catalisa a degradação de substratos específicos, gerando um sinal. Uma variedade de conjugados de estreptavidina, proteína A, proteína G e anticorpos secundários estão disponíveis para western blot. Também oferecemos uma ampla variedade de substratos para HRP e FA para detecção quimioluminescente, cromogênica e quimiofluorescente em western blot.
SUBSTRATOS QUIMIOLUMINESCENTES PARA WESTERN BLOT
Os substratos para HRP Immobilon® para detecção quimioluminescente aumentam a sensibilidade de blots mais quantitativos, reduzindo os custos e permitindo diminuir a concentração de anticorpos usados para detecção. Escolha dentre um portfólio de substratos Immobilon® com graus de sensibilidade variados em formatos prontos para uso convenientes ou de dois componentes para otimizar a detecção para a sua aplicação de western blot.
- Os substratos quimioluminescentes Immobilon® Classico, Crescendo e Forte compreendem uma família de reagentes pré-misturados e prontos para uso para detecção à base de peroxidase, oferecidos com diversos graus de sensibilidade para fornecer razões sinal-ruído ideais ao longo de um espectro de concentrações da proteína-alvo. Limites de detecção:
- Immobilon® Classico: ~ 6 pg de proteína-alvo
- Immobilon® Crescendo: ~ 1-3 pg de proteína-alvo
- Immobilon® Forte: ~ 400 fg de proteína-alvo
- Os substratos Immobilon® Western HRP, Immobilon® ECL Ultra e Immobilon® UltraPlus Western conferem sensibilidade excepcional e longa duração de sinal em formatos padrão de dois componentes. Essas formulações possibilitam o uso de soluções de anticorpo primário mais diluídas para detecção por imunoblotting. Limites de detecção:
- Substrato de HRP para western blot Immobilon® ~ 400 fg de proteína-alvo
- Substrato Immobilon® para ECL Ultra: intervalo menor de fentogramas
- Substrato Immobilon® ECL UltraPlus Western Blot HRP: intervalo menor de fentogramas
Grau de sensibilidade relativo dos substratos Immobilon® quimioluminescentes com HRP
Figura 1.Uma série de diluições duplas do lisado de células A431 [12-110], começando com 4 μg de proteína, foi executada em géis mPAGE® a 10% [MP10W15] em tampão MOPS [MPM0PS] a 200 V por 25 minutos. A proteína foi transferida para a membrana Immobilon®-P [IPVH00010] por 1 hora em tampão de transferência mPAGE® [MPTRB] com 10% de etanol. A imunodetecção da proteína HH3 (15 kDa) foi realizada com anticorpos anti-HH3 [H0164] de coelho e anticoelho de cabra [AP132P] nas diluições listadas. Os blots foram incubados com os reagentes ECL indicados por 5 minutos e as imagens foram tiradas com uma exposição de 30 segundos no sistema Bio-Rad® ChemiDoc.
Os reagentes para detecção Cytiva™ Amersham™ ECL (quimioluminescência aprimorada) usam detecção de HRP à base de luminol aprimorada, com diferentes formulações disponíveis para abranger diferentes necessidades de aplicação de western blot.
- Os reagentes de detecção para western blot Cytiva Amersham™ ECL são recomendados para aplicações confirmatórias de western blot.
- Os reagentes de detecção para western blot Cytiva Amersham™ ECL Prime possibilitam a detecção de proteínas muito e pouco abundantes no mesmo blot.
- Os reagentes de detecção para western blot Cytiva Amersham™ ECL Select oferecem alta sensibilidade mesmo quando usam anticorpos primários e secundários diluídos.
- O reagente de detecção para western blot Cytiva Amersham™ ECL Start foi desenvolvido para detecção quimioluminescente de proteínas de média e alta expressão.
SUBSTRATOS CROMOGÊNICOS PARA WESTERN BLOT
A detecção cromogênica utiliza uma enzima conjugada com peroxidase (p. ex., HRP) ou fosfatase alcalina (FA) para catalisar uma reação que resulta na deposição de um precipitado colorido insolúvel para detecção. Os nossos substratos cromogênicos para western blot estão disponíveis nas formas de solução, pó e comprimido para fornecer opções flexíveis de armazenamento e uso.
- Os comprimidos SIGMAFAST™ DAB (substrato para HRP cromogênico) são compostos de um substrato de precipitação colorimétrico que produz uma cor marrom após a reação com peroxidase de rábano e podem ser dissolvidos em água para preparar uma solução tamponada pronta para uso para detecção em blots.
- Os reagentes Single Reagent BCIP/NBT (azul/roxo) e BCIP/TNBT (azul/marrom) são substratos colorimétricos altamente sensíveis para fosfatase alcalina.
- O TMB Enhanced One Component HRP Membrane Substrate (substrato para HRP cromogênico) é um substrato colorimétrico de um único componente que gera um produto azul escuro.
Substrato | Cor | Enzima | Sensibilidade |
|---|---|---|---|
BCIP/NBT | Azul/roxo | FA | Alta |
Vermelho rápido TR (4-cloro-2-metilbenzenodiazônio) | Vermelho/laranja | FA | Alta |
DAB (3,3’-diaminobenzidina) | Marrom | HRP | Média |
TMB (3,3′,5,5'-tetrametilbenzidina) | Azul escuro | HRP | Alta |
CN (4-cloro-1-naftol) | Azul/roxo | HRP | Baixa |
Intensificadores de sinal
- O intensificador de sinal Immobilon® foi projetado para uso em aplicações de western blot com baixa intensidade de sinal. O aprimoramento da reação anticorpo-antígeno pode aumentar a intensidade do sinal de 2 a 10 vezes. O intensificador de sinal Immobilon® é compatível com membranas de PVDF e de nitrocelulose e pode ser usado com métodos de detecção cromogênicos, quimioluminescentes e fluorescentes.
- O kit intensificador de imunorreações SignalBoost™ é projetado para melhorar o sinal quimioluminescente ou colorimétrico do alvo em membranas de nitrocelulose ou PVDF
Reagentes e kits para remoção e readição
Os reagentes para remoção e readição são especialmente formulados para remover anticorpos de western blot de forma rápida e eficaz sem afetar substancialmente as proteínas imobilizadas.
- Os reagentes ReBlot™ Plus removem com eficiência os anticorpos ligados aos blots com sonda. Os reagentes ReBlot™ Plus estão disponíveis em formulações brandas e fortes.
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