Protocolo Western Blotting (Protocolo Immunoblotting)

O Western blot refere-se à transferência eletroforética de proteínas de géis de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida para folhas de PVDF ou membrana de nitrocelulose, seguida de imunodetecção de proteínas utilizando anticorpos com detecção fluorescente ou quimioluminescente. 

Sequência de passos do Western blotting

1. Preparo de amostras: Lise celular e extração de proteínas
2. Eletroforese em gel SDS-PAGE
3. Transferência de membrana
   a) Transferência de tanque
   b) Transferência semisseca
4. Imunodetecção
   a) Imunodetecção tradicional
   b) Protocolo de imunodetecção de 30 minutos usando o sistema SNAP i.d.^®
   
5. Guia de solução de problemas

Protocolo de transferência de membrana (transferência de tanque)

Materiais

• Mata-borrão
• Membrana de transferência (por exemplo, membranas Immobilon^® PVDF)
• Tampão de transferência
• Metanol, etanol ou isopropanol
• Sistema de transferência de tanque (por exemplo, sistema de eletroblotting mini SB10 omniPAGE)
• Fonte de alimentação elétrica
  

Ajustes

1. Prepare um tampão de transferência suficiente para encher o tanque de transferência, além de 200 ml adicionais para equilibrar o gel e a membrana e molhar o papel de filtro.
   
2. Retire o gel do cassete; apare qualquer gel de empilhamento e poços.
   
3. Mergulhe o gel no tampão de transferência por 10 a 30 minutos.
   
4. Mergulhe os papéis de filtro no tampão de transferência por pelo menos 30 segundos.
   
5. Prepare a membrana:
   
       a. Se estiver usando membrana em PVDF, molhe a membrana em metanol por 15 segundos. A membrana deve mudar uniformemente
   de opaca para semitransparente.
       b. Coloque cuidadosamente a membrana em água Milli-Q^® e deixe de molho por 2 minutos.
       c. Coloque cuidadosamente a membrana no tampão de transferência e deixe equilibrar por pelo menos 5 minutos.

Transfira o conjunto de pilha

1. Abra o porta-cassete.
   
   Importante: Para garantir uma transferência uniforme, remova as bolhas de ar entre as camadas com um Blot Roller ou role cuidadosamente uma pipeta, ou uma haste de agitação sobre a superfície de cada camada da pilha. Não pressione excessivamente para evitar danificar a membrana e o gel.
   
   
2. Coloque uma placa de espuma (fibra) em um lado do cassete.
   
3. Coloque uma folha de papel de filtro em cima da placa.
   
4. Coloque o gel em cima do papel de filtro.
   
5. Coloque a membrana em cima do gel.
   
6. Coloque uma segunda folha de papel de filtro no topo da pilha.
   
7. Coloque a segunda placa de espuma em cima do papel de filtro.
   
8. Feche o porta-cassete.

Método para transferência de proteínas (transferência de tanque)

1. Coloque o porta-cassete no tanque de transferência de forma que o lado do gel do porta-cassete fique voltado para o cátodo (–) e o lado da membrana fique voltado para o ânodo (+).
   
2. Adicione um tampão adequado ao tanque para cobrir o porta-cassete.
   
3. Insira o fio catódico preto (–) na tomada do cátodo e o fio anódico vermelho (+) na tomada do ânodo na unidade de transferência.
   
4. Conecte o cabo do ânodo e o cabo do cátodo às suas saídas de energia correspondentes.
   
5. Se disponível, instale a unidade de resfriamento na unidade de transferência do tanque de acordo com as instruções do fabricante.
   
6. Ligue o sistema por 1 a 2 horas a uma distância entre eletrodos de 6 a 8 V/cm. Siga as orientações do fabricante do tanque para obter detalhes de otimização.
   
7. Após a conclusão da transferência, remova o porta-cassete do tanque.
   
8. Usando uma pinça, desmonte cuidadosamente a pilha de transferência.
    

Dicas para uma transferência bem-sucedida de Western blot

• Em ambos os tipos de sistemas de transferência (tanque e semisseco), deve-se tomar cuidado extra para evitar a introdução de bolhas de ar em qualquer lugar entre o papel de filtro, gel ou membrana. 
• Transferir proteínas em corrente constante. Se estiver transferindo em tensão constante, monitore a corrente para garantir que não exceda 0,4 A. Comece com 100 V e reduza a tensão se a corrente for muito alta
  
• Géis mais espessos ou proteínas maiores podem exigir tempos de transferência mais longos ou maior intensidade de campo. As condições reais de transferência devem ser otimizadas para cada sistema.
• Ambos os lados das membranas de transferência Immobilon® funcionam igualmente bem. A aparência de qualquer um dos lados (brilhante ou opaco) não afeta a eficiência de transferência e detecção da membrana.
• Para amostras contendo pequenos peptídeos, o equilíbrio do gel no tampão de transferência deve ser limitado a menos de 10 minutos.
• Use o Immobilon® PSQ para retenção máxima quando uma proteína de interesse tiver 20 kDa ou menos.
• Use a membrana de transferência Immobilon®-FL para métodos de detecção fluorescente.
• Os géis podem ser transferidos individualmente ou vários géis podem ser transferidos em uma única pilha.

Protocolo de transferência de membrana semisseca

Materiais

• Mata-borrão
• Membrana de transferência (por exemplo, membranas Immobilon^® PVDF)
• Tampão anódico I: Tris 0,3 M, pH 10,4, metanol a 10% (v/v).
• Tampão anódico II: Tris 25 mM, pH 10,4, metanol a 10% (v/v).
• Tampão catódico: Tris 25 mM, ácido 6-amino-n-capróico 40 mM (a glicina pode ser substituída), metanol a 10% (v/v), pH 9,4.
• Mata-borrão semisseco (por exemplo, Produto nº B2529)
• Fonte de alimentação elétrica

Ajustes

1. Prepare 200 ml de cada tampão anódico e 400 ml de tampão cátodo.
   
2. Retire o gel do cassete; apare qualquer gel de empilhamento.
   
3. Mergulhe o gel em 200 ml de tampão catódico por 15 minutos.
   
4. Mergulhe dois pedaços de papel de filtro no tampão anódico I por pelo menos 30 segundos.
   
5. Mergulhe um pedaço de papel de filtro em tampão anódico II por pelo menos 30 segundos.
   
6. Mergulhe três pedaços de papel de filtro em tampão catódico por pelo menos 30 segundos.
   
7. Prepare a membrana:
       a. Molhe a membrana em metanol por 15 segundos. A membrana deve mudar uniformemente de opaca para semitransparente.
       b. Coloque cuidadosamente a membrana em água Milli-Q^® e deixe de molho por 2 minutos.
       c. Coloque cuidadosamente a membrana no tampão anódico II e deixe equilibrar por pelo menos 5 minutos.

Para transferências únicas:

1. Coloque a placa do eletrodo anódico em uma bancada nivelada.
   
2. Coloque dois pedaços de papel de filtro embebidos em tampão anódico I no centro da placa.
   
3. Coloque o papel de filtro embebido em tampão anódico II sobre as duas primeiras folhas.
   
4. Coloque a membrana em cima dos papéis de filtro.
   
5. Coloque o gel em cima da membrana.
   
6. Coloque os três pedaços de papel de filtro embebidos em tampão catódico no topo da membrana.
   
7. Coloque a placa do eletrodo catódico no topo da pilha.

Para múltiplas transferências:

1. Coloque a placa do eletrodo anódico em uma bancada nivelada.
   
2. Coloque dois pedaços de papel de filtro embebidos em tampão anódico I no centro da placa.
   
3. Coloque o papel de filtro embebido em tampão anódico II sobre as duas primeiras folhas.
   
4. Coloque a membrana em cima dos papéis de filtro.
   
5. Coloque o gel em cima da membrana.
   Para o último gel, vá para a etapa 10.
   
6. Coloque um pedaço de papel de filtro embebido em tampão catódico em cima do gel.
   
7. Coloque um pedaço de membrana de diálise em cima do papel de filtro.
   
8. Coloque um pedaço de papel de filtro embebido em tampão anódico II no topo da membrana de diálise.
   
9. Repita as etapas 4 a 8 até que todos os géis (até o máximo da unidade) tenham sido incorporados à pilha.
   
10. Coloque três pedaços de papel de filtro embebidos em tampão catódico em cima do último gel.
    
11. Coloque a placa do eletrodo catódico no topo da pilha.
    
    IMPORTANTE: Não bata na tampa da placa catódica durante a execução, pois isso pode perturbar o alinhamento da pilha de transferência e causar resultados imprecisos.

Método para transferência de proteínas (semisseco)

1. Insira o fio catódico preto (–) na tomada da placa catódica.
   
2. Insira o fio anódico vermelho (+) na tomada da placa anódica.
   
3. Conecte o cabo anódico e o cabo catódico às suas saídas de fonte de alimentação correspondentes.
   
4. Ligue a fonte de alimentação.
   
5. Defina a corrente e deixe-a funcionar pelo tempo indicado na tabela a seguir:

Tabela 1.Tempos recomendados para transferência de proteína semisseca

Densidade da corrente	Limite de tempo
0,8 mA/cm2	1 a 2 horas
1,2 mA/cm2	1 hora
2,5 mA/cm2	30 a 45 min
4,0 mA/cm2	10 a 30 min

*A área de superfície (cm²) é calculada a partir das dimensões da pegada da pilha na placa anódica. Esse valor não depende do número de géis na pilha.

Imunodetecção tradicional

Materiais

• Anticorpos primários e secundários
• Agitador orbital* (Produto nº Z768499)
• Canais com 2-3 mm de profundidade, ligeiramente maiores que o tamanho da sua amostra
• Substratos de detecção (para uso com conjugados de anticorpo peroxidase ou fosfatase)
  - Substratos de quimioluminescência
  - Substratos cromogênicos

*Agitador e canais necessários apenas para imunodetecção tradicional; para imunodetecção rápida acionada por vácuo usando o
sistema SNAP i.d.^®, consulte o protocolo de imunodetecção SNAP i.d.^®.

Incubações de anticorpos

1. Coloque a amostra na solução de bloqueio e incube com agitação durante 1 hora.
   
2. Coloque a amostra na solução de anticorpo primário, por exemplo Anticorpo monoclonal anti-beta-actina e incube com agitação durante 1 hora. A solução deve mover-se livremente pela superfície da membrana.
   
3. Coloque a amostra em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão novo.
   
4. Coloque a amostra na solução de anticorpo secundário e incube com agitação durante 1 hora em temperatura ambiente ou 37 °C.
   
5. Coloque a amostra em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão novo.
   
6. Prossiga com detecção cromogênica, quimioluminescente ou fluorescente. Veja também recursos relacionados para detecção de proteínas:
       Detecção cromogênica e quimiluminescente de proteínas
       Imunodetecção usando substrato BCIP/NBT

Detecção quimioluminescente

Siga as instruções do fabricante.

1. Prepare o substrato de acordo com as instruções do fabricante.
   
2. Coloque a amostra em um recipiente e adicione substrato para cobrir completamente a membrana.
   Incube por 1 minuto.
   
3. Drene o excesso de substrato.
   
4. Coloque a amostra em um pedaço de vidro limpo e embrulhe em filme plástico.
   Observação: Um protetor de folha cortado sob medida ou um saco para congelador também podem ser usados.
   
5. Suavize gentilmente quaisquer bolhas de ar.
   
6. Em uma sala escura, coloque a membrana embrulhada em um cassete de filme.
   
7. Coloque uma folha de filme de autorradiografia por cima e feche o cassete.
   
8. Revele o filme. Múltiplas exposições de 15 segundos a 30 minutos devem ser feitas para determinar o tempo ideal de exposição; de 1 a 5 minutos é comum.

Detecção fluorescente

Equipamento necessário

• As proteínas para blotting foram transferidas para a membrana de transferência Immobilon^®-FL e sondadas com anticorpos.
  
• Invólucro Mylar^®.
  
• Equipamento de imagem fluorescente.

O seguinte é um protocolo geral para imunodetecção fluorescente. Para melhores resultados, consulte o protocolo do fabricante fornecido com os reagentes.

Observação: Se utilizar reagentes quimiofluorescentes, siga as instruções do fabricante do reagente.

1. Coloque a amostra em solução diluída de anticorpo secundário marcada com corante fluorescente e incube por 1 hora com agitação suave.
   
2. Lave a amostra com tampão de lavagem de 3 a 5 vezes durante 5 minutos cada.
   
3. Coloque a amostra em um pedaço de papel de filtro limpo para secar.
   
4. Se estiver usando um invólucro, use o Mylar^®. Não use o invólucro Saran™, pois ele permite que a luz brilhe e apague a fluorescência.
   
5. Imagem da amostra usando um scanner de fluorescência apropriado.

Tabela 2.Guia de solução de problemas de Western Blotting

Problema	Possível causa	Solução
Nenhum sinal ou sinal fraco, ou bandas não específicas	Substrato ou conjugado fraco, ou inativo devido à idade, ou armazenamento inadequado	Teste o conjugado e o substrato para atividade. Por exemplo, adicione o conjugado enzimático à solução de substrato. Isso deve mudar a cor.
	Se a detecção quimioluminescente estiver sendo usada, a solução de revelação do filme pode ter expirado	Use soluções novas de revelação de filme.
	Substrato incorreto para aplicação	Certifique-se de que o substrato selecionado é apropriado para o conjugado enzimático.
	Substrato preparado incorretamente	Siga as instruções que acompanham o substrato. Certifique-se de adicionar H2O2 novo, se necessário.
	Diluição incorreta de anticorpo primário ou secundário	Verifique a literatura ou a ficha técnica para obter as diluições recomendadas para os anticorpos utilizados. Experimente uma variedade de diluições. Mais nem sempre é melhor, especialmente com sistemas de detecção sensíveis, como a quimioluminescência. A maioria dos nossos anticorpos é testada com substratos colorimétricos que não são muito sensíveis. Por esse motivo, pode ser necessário diluir o anticorpo 5-10 vezes mais se a detecção quimioluminescente estiver sendo utilizada. Use o nosso Guia de anticorpos secundários para dicas sobre como selecionar anticorpos secundários.
	Anticorpo primário incorreto para a aplicação	Certifique-se de que o anticorpo funcione em imunotransferência. Nem todos os anticorpos funcionam em todas as aplicações. O anticorpo primário pode não ser capaz de reagir com a proteína de interesse da espécie em estudo. Verifique a bibliografia/folha de dados e informações sobre sequência de proteínas.
	A proteína de interesse não está presente ou está presente em pequenas quantidades	Se o controle positivo funcionou, verifique a quantidade de proteína carregada. Se necessário, tente enriquecer a quantidade de proteína de interesse na amostra carregada por imunoprecipitação ou por purificação. Use um dos nossos anticorpos de controle de carga para garantir a transferência adequada de proteínas. Consulte a bibliografia para saber a melhor fonte da proteína de interesse. Consulte “Má transferência de proteínas” abaixo.
	Anticorpo secundário inadequado para a aplicação	O anticorpo secundário pode não ser capaz de se ligar ao anticorpo primário. Teste isso detectando o anticorpo primário em um pequeno pedaço de membrana. Quando a mancha secar, bloqueie, e então sonde com secundário diluído, lave e revele com substrato. Um ponto deve aparecer se o secundário estiver vinculado ao primário.
	Tempos de incubação inadequados	Incubar pelo menos uma hora com anticorpo primário.
	Inibidor enzimático presente	A azida de sódio inibirá as reações da peroxidase.
	Lavagem excessiva	Reduza os tempos de lavagem, exclua os detergentes dos tampões de lavagem.
	Má transferência de proteínas	Verifique a transferência das proteínas para a membrana colorindo a membrana com Ponceau S (Produto nº P7170) antes do bloqueio. Certifique-se de que a membrana esteja molhada uniformemente antes da transferência. Teste os tempos de transferência. Proteínas pequenas (<10.000) podem ter sido transferidas através da membrana (tente incluir uma segunda membrana atrás da primeira). Proteínas maiores podem exigir tempos de transferência mais longos. Verifique o tampão de transferência - altas concentrações de metanol podem impedir a transferência da proteína do gel. 0,005-0,01% de SDS no tampão de transferência pode aumentar a transferência de proteína do gel, mas também pode interferir na ligação da proteína à membrana. Se o pI da proteína for> 9,0, tente usar CAPS, pH 9, como tampão de transferência. Use um dos nossos anticorpos de controle de carga para garantir a transferência adequada de proteínas.
	Os reagentes podem ter perdido atividade devido ao armazenamento e manuseio inadequados	Verifique a ficha técnica do produto para obter instruções de armazenamento. Evite congelamento/descongelamento excessivo. Nos casos de anticorpos conjugados com fluoróforo, certifique-se de que o anticorpo não foi exposto à luz.
Fundo alto ou bandas não específicas	Bloqueio insuficiente	Experimente diferentes estratégias de bloqueio: Tempos de bloqueio mais longos, maior % de bloqueador, um bloqueador diferente, inclusão de proteína bloqueadora em diluições de anticorpos ou experimente um novo lote do mesmo bloqueador.
	O anticorpo primário pode não ser suficientemente específico	Experimente um anticorpo monoclonal ou policlonal purificado por afinidade.
	Alta concentração de anticorpo primário	Verifique a literatura ou a folha de dados para a diluição recomendada do primário. Experimente uma variedade de diluições para otimizar seu sistema.
	Alta concentração de anticorpo secundário	Teste isso executando uma pista de amostra extra e omitindo a incubação do anticorpo primário do procedimento. Se este controle “somente secundário” resultar em coloração inespecífica, tente diluições adicionais do anticorpo secundário ou tente outro secundário.
	O anticorpo secundário está reagindo de forma cruzada com outras proteínas na amostra	Diluir o anticorpo secundário em tampão contendo 1-5% de soro normal da mesma espécie que a amostra. Use o nosso Guia de anticorpos secundários para dicas sobre como selecionar anticorpos secundários.
	Múltiplas bandas podem ser fragmentos proteolíticos da proteína de interesse	Certifique-se de que os inibidores de protease estejam presentes desde a primeira etapa da preparação da amostra. Armazene e manuseie as preparações de amostras para reduzir a chance de proteólise. Experimente amostras frescas quando possível.
	Tempos de incubação de anticorpos mais longos que o necessário	Reduza os tempos de incubação.
	Incubação excessiva com solução de substrato colorimétrico	Diminua o tempo de coloração. Exponha a membrana ao substrato até que um sinal positivo seja visto. Pare a reação lavando a membrana antes que o fundo se desenvolva.
	Lavagem inadequada	Aumente o número ou o rigor das lavagens.
	Enzimas contaminantes presentes na amostra	Teste a amostra apenas com substrato para verificar a atividade enzimática contaminante na amostra de proteína.
Manchas pretas	O reagente de bloqueio se aglomerou e os anticorpos estão se ligando a ele	Filtre o reagente de bloqueio.
	Enzimas contaminantes estão presentes na amostra ou estão contaminando o tampão de bloqueio	Filtre o tampão de bloqueio.
As bandas não estão paralelas	O gel não polimerizou paralelamente	Revise o procedimento de preparação do gel.