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Página inicialWestern blotProtocolo Western Blotting (Protocolo Immunoblotting)

Protocolo Western Blotting (Protocolo Immunoblotting)

O Western blot refere-se à transferência eletroforética de proteínas de géis de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida para folhas de PVDF ou membrana de nitrocelulose, seguida de imunodetecção de proteínas utilizando anticorpos com detecção fluorescente ou quimioluminescente. 

Sequência de passos do Western blotting

  1. Preparo de amostras: Lise celular e extração de proteínas
  2. Eletroforese em gel SDS-PAGE
  3. Transferência de membrana
    a) Transferência de tanque
    b) Transferência semisseca
  4. Imunodetecção
    a) Imunodetecção tradicional
    b) Protocolo de imunodetecção de 30 minutos usando o sistema SNAP i.d.®
  5. Guia de solução de problemas

Protocolo de transferência de membrana (transferência de tanque)

Materiais

  • Mata-borrão
  • Membrana de transferência (por exemplo, membranas Immobilon® PVDF)
  • Tampão de transferência
  • Metanol, etanol ou isopropanol
  • Sistema de transferência de tanque (por exemplo, sistema de eletroblotting mini SB10 omniPAGE)
  • Fonte de alimentação elétrica

Ajustes

  1. Prepare um tampão de transferência suficiente para encher o tanque de transferência, além de 200 ml adicionais para equilibrar o gel e a membrana e molhar o papel de filtro.
  2. Retire o gel do cassete; apare qualquer gel de empilhamento e poços.
  3. Mergulhe o gel no tampão de transferência por 10 a 30 minutos.
  4. Mergulhe os papéis de filtro no tampão de transferência por pelo menos 30 segundos.
  5. Prepare a membrana:

        a. Se estiver usando membrana em PVDF, molhe a membrana em metanol por 15 segundos. A membrana deve mudar uniformemente
    de opaca para semitransparente.
        b. Coloque cuidadosamente a membrana em água Milli-Q® e deixe de molho por 2 minutos.
        c. Coloque cuidadosamente a membrana no tampão de transferência e deixe equilibrar por pelo menos 5 minutos.

Transfira o conjunto de pilha

  1. Abra o porta-cassete.

    Importante: Para garantir uma transferência uniforme, remova as bolhas de ar entre as camadas com um Blot Roller ou role cuidadosamente uma pipeta, ou uma haste de agitação sobre a superfície de cada camada da pilha. Não pressione excessivamente para evitar danificar a membrana e o gel.

  2. Coloque uma placa de espuma (fibra) em um lado do cassete.
  3. Coloque uma folha de papel de filtro em cima da placa.
  4. Coloque o gel em cima do papel de filtro.
  5. Coloque a membrana em cima do gel.
  6. Coloque uma segunda folha de papel de filtro no topo da pilha.
  7. Coloque a segunda placa de espuma em cima do papel de filtro.
  8. Feche o porta-cassete.

Método para transferência de proteínas (transferência de tanque)

  1. Coloque o porta-cassete no tanque de transferência de forma que o lado do gel do porta-cassete fique voltado para o cátodo (–) e o lado da membrana fique voltado para o ânodo (+).
  2. Adicione um tampão adequado ao tanque para cobrir o porta-cassete.
  3. Insira o fio catódico preto (–) na tomada do cátodo e o fio anódico vermelho (+) na tomada do ânodo na unidade de transferência.
  4. Conecte o cabo do ânodo e o cabo do cátodo às suas saídas de energia correspondentes.
  5. Se disponível, instale a unidade de resfriamento na unidade de transferência do tanque de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Ligue o sistema por 1 a 2 horas a uma distância entre eletrodos de 6 a 8 V/cm. Siga as orientações do fabricante do tanque para obter detalhes de otimização.
  7. Após a conclusão da transferência, remova o porta-cassete do tanque.
  8. Usando uma pinça, desmonte cuidadosamente a pilha de transferência.
     

Dicas para uma transferência bem-sucedida de Western blot

  • Em ambos os tipos de sistemas de transferência (tanque e semisseco), deve-se tomar cuidado extra para evitar a introdução de bolhas de ar em qualquer lugar entre o papel de filtro, gel ou membrana. 
  • Transferir proteínas em corrente constante. Se estiver transferindo em tensão constante, monitore a corrente para garantir que não exceda 0,4 A. Comece com 100 V e reduza a tensão se a corrente for muito alta
  • Géis mais espessos ou proteínas maiores podem exigir tempos de transferência mais longos ou maior intensidade de campo. As condições reais de transferência devem ser otimizadas para cada sistema.
  • Ambos os lados das membranas de transferência Immobilon® funcionam igualmente bem. A aparência de qualquer um dos lados (brilhante ou opaco) não afeta a eficiência de transferência e detecção da membrana.
  • Para amostras contendo pequenos peptídeos, o equilíbrio do gel no tampão de transferência deve ser limitado a menos de 10 minutos.
  • Use o Immobilon® PSQ para retenção máxima quando uma proteína de interesse tiver 20 kDa ou menos.
  • Use a membrana de transferência Immobilon®-FL para métodos de detecção fluorescente.
  • Os géis podem ser transferidos individualmente ou vários géis podem ser transferidos em uma única pilha.

Protocolo de transferência de membrana semisseca

Materiais

  • Mata-borrão
  • Membrana de transferência (por exemplo, membranas Immobilon® PVDF)
  • Tampão anódico I: Tris 0,3 M, pH 10,4, metanol a 10% (v/v).
  • Tampão anódico II: Tris 25 mM, pH 10,4, metanol a 10% (v/v).
  • Tampão catódico: Tris 25 mM, ácido 6-amino-n-capróico 40 mM (a glicina pode ser substituída), metanol a 10% (v/v), pH 9,4.
  • Mata-borrão semisseco (por exemplo, Produto nº B2529)
  • Fonte de alimentação elétrica

Ajustes

  1. Prepare 200 ml de cada tampão anódico e 400 ml de tampão cátodo.
  2. Retire o gel do cassete; apare qualquer gel de empilhamento.
  3. Mergulhe o gel em 200 ml de tampão catódico por 15 minutos.
  4. Mergulhe dois pedaços de papel de filtro no tampão anódico I por pelo menos 30 segundos.
  5. Mergulhe um pedaço de papel de filtro em tampão anódico II por pelo menos 30 segundos.
  6. Mergulhe três pedaços de papel de filtro em tampão catódico por pelo menos 30 segundos.
  7. Prepare a membrana:
        a. Molhe a membrana em metanol por 15 segundos. A membrana deve mudar uniformemente de opaca para semitransparente.
        b. Coloque cuidadosamente a membrana em água Milli-Q® e deixe de molho por 2 minutos.
        c. Coloque cuidadosamente a membrana no tampão anódico II e deixe equilibrar por pelo menos 5 minutos.

Para transferências únicas:

  1. Coloque a placa do eletrodo anódico em uma bancada nivelada.
  2. Coloque dois pedaços de papel de filtro embebidos em tampão anódico I no centro da placa.
  3. Coloque o papel de filtro embebido em tampão anódico II sobre as duas primeiras folhas.
  4. Coloque a membrana em cima dos papéis de filtro.
  5. Coloque o gel em cima da membrana.
  6. Coloque os três pedaços de papel de filtro embebidos em tampão catódico no topo da membrana.
  7. Coloque a placa do eletrodo catódico no topo da pilha.

Para múltiplas transferências:

  1. Coloque a placa do eletrodo anódico em uma bancada nivelada.
  2. Coloque dois pedaços de papel de filtro embebidos em tampão anódico I no centro da placa.
  3. Coloque o papel de filtro embebido em tampão anódico II sobre as duas primeiras folhas.
  4. Coloque a membrana em cima dos papéis de filtro.
  5. Coloque o gel em cima da membrana.
    Para o último gel, vá para a etapa 10.
  6. Coloque um pedaço de papel de filtro embebido em tampão catódico em cima do gel.
  7. Coloque um pedaço de membrana de diálise em cima do papel de filtro.
  8. Coloque um pedaço de papel de filtro embebido em tampão anódico II no topo da membrana de diálise.
  9. Repita as etapas 4 a 8 até que todos os géis (até o máximo da unidade) tenham sido incorporados à pilha.
  10. Coloque três pedaços de papel de filtro embebidos em tampão catódico em cima do último gel.
  11. Coloque a placa do eletrodo catódico no topo da pilha.

    IMPORTANTE: Não bata na tampa da placa catódica durante a execução, pois isso pode perturbar o alinhamento da pilha de transferência e causar resultados imprecisos.

Método para transferência de proteínas (semisseco)

  1. Insira o fio catódico preto (–) na tomada da placa catódica.
  2. Insira o fio anódico vermelho (+) na tomada da placa anódica.
  3. Conecte o cabo anódico e o cabo catódico às suas saídas de fonte de alimentação correspondentes.
  4. Ligue a fonte de alimentação.
  5. Defina a corrente e deixe-a funcionar pelo tempo indicado na tabela a seguir:
Tabela 1.Tempos recomendados para transferência de proteína semisseca

*A área de superfície (cm2) é calculada a partir das dimensões da pegada da pilha na placa anódica. Esse valor não depende do número de géis na pilha.

Imunodetecção tradicional

Materiais

  • Anticorpos primários e secundários
  • Agitador orbital* (Produto nº Z768499)
  • Canais com 2-3 mm de profundidade, ligeiramente maiores que o tamanho da sua amostra
  • Substratos de detecção (para uso com conjugados de anticorpo peroxidase ou fosfatase)
    - Substratos de quimioluminescência
    Substratos cromogênicos

*Agitador e canais necessários apenas para imunodetecção tradicional; para imunodetecção rápida acionada por vácuo usando o
sistema SNAP i.d.®, consulte o protocolo de imunodetecção SNAP i.d.®.

Incubações de anticorpos

  1. Coloque a amostra na solução de bloqueio e incube com agitação durante 1 hora.
  2. Coloque a amostra na solução de anticorpo primário, por exemplo Anticorpo monoclonal anti-beta-actina e incube com agitação durante 1 hora. A solução deve mover-se livremente pela superfície da membrana.
  3. Coloque a amostra em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão novo.
  4. Coloque a amostra na solução de anticorpo secundário e incube com agitação durante 1 hora em temperatura ambiente ou 37 °C.
  5. Coloque a amostra em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão novo.
  6. Prossiga com detecção cromogênica, quimioluminescente ou fluorescente. Veja também recursos relacionados para detecção de proteínas:
        Detecção cromogênica e quimiluminescente de proteínas
        Imunodetecção usando substrato BCIP/NBT

Detecção quimioluminescente

Siga as instruções do fabricante.

  1. Prepare o substrato de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Coloque a amostra em um recipiente e adicione substrato para cobrir completamente a membrana.
    Incube por 1 minuto.
  3. Drene o excesso de substrato.
  4. Coloque a amostra em um pedaço de vidro limpo e embrulhe em filme plástico.
    Observação: Um protetor de folha cortado sob medida ou um saco para congelador também podem ser usados.
  5. Suavize gentilmente quaisquer bolhas de ar.
  6. Em uma sala escura, coloque a membrana embrulhada em um cassete de filme.
  7. Coloque uma folha de filme de autorradiografia por cima e feche o cassete.
  8. Revele o filme. Múltiplas exposições de 15 segundos a 30 minutos devem ser feitas para determinar o tempo ideal de exposição; de 1 a 5 minutos é comum.

Detecção fluorescente

Equipamento necessário

  • As proteínas para blotting foram transferidas para a membrana de transferência Immobilon®-FL e sondadas com anticorpos.
  • Invólucro Mylar®.
  • Equipamento de imagem fluorescente.

O seguinte é um protocolo geral para imunodetecção fluorescente. Para melhores resultados, consulte o protocolo do fabricante fornecido com os reagentes.

Observação: Se utilizar reagentes quimiofluorescentes, siga as instruções do fabricante do reagente.

  1. Coloque a amostra em solução diluída de anticorpo secundário marcada com corante fluorescente e incube por 1 hora com agitação suave.
  2. Lave a amostra com tampão de lavagem de 3 a 5 vezes durante 5 minutos cada.
  3. Coloque a amostra em um pedaço de papel de filtro limpo para secar.
  4. Se estiver usando um invólucro, use o Mylar®. Não use o invólucro Saran™, pois ele permite que a luz brilhe e apague a fluorescência.
  5. Imagem da amostra usando um scanner de fluorescência apropriado.
Tabela 2.Guia de solução de problemas de Western Blotting
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