Água ultrapura para meios de cultura sem BPA
O objetivo deste estudo foi estabelecer uma técnica para detectar baixos níveis do desregulador endócrino bisfenol A (BPA) na água e, mais especificamente, documentar como um sistema de purificação de água Milli-Q® IQ 7000 equipado com um ultrafiltro Biopak® (configuração recomendada para aplicações de biologia molecular) produz água ultrapura de referência adequada para pesquisas embriológicas sensíveis ao BPA.
Leia mais sobre
- Preocupações com a saúde de desreguladores endócrinos, como o bisfenol A
- Estudo 1: HP-SPME-GC-MS para medir BPA em água ultrapura usada em pesquisas de embriologia
- Estudo 2: Água ultrapura sem BPA para análises citológicas e moleculares para avaliar o impacto do BPA na maturação dos oócitos
- Estudo 3: Água ultrapura sem BPA para meios usados na tecnologia de imagem de células
- Conclusão: Água ultrapura para aplicações sensíveis ao BPA em estudos de embriogênese
- Materiais e métodos para a análise de BPA por HP-SPME-GC-MS
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Preocupações com a saúde de desreguladores endócrinos, como o bisfenol A
Os desreguladores endócrinos são substâncias químicas que interferem no sistema endócrino de humanos e animais. Eles afetam o crescimento, a reprodução e os sistemas imunológico e nervoso, causando consequências adversas à saúde. Encontrados em plásticos (incluindo consumíveis e equipamentos de laboratório), vernizes, resinas e surfactantes, os desreguladores endócrinos são considerados onipresentes.
As normas e os padrões regulam as doses máximas de desreguladores endócrinos permitidas em produtos alimentícios e bebidas, bem como sua presença no meio ambiente. Entre os vários desreguladores endócrinos produzidos industrialmente, o BPA é um dos mais comuns. O BPA é conhecido como um “xenoestrogênio”, pois imita o hormônio estrogênio e, consequentemente, gera grandes preocupações relacionadas à saúde. Vários estudos confirmaram que o BPA interfere na produção de hormônios e na expressão de seus genes. Pesquisas recentes revelaram que mesmo níveis baixos de BPA (20 µg/kg/dia, o que representa uma dose ambientalmente relevante de BPA durante uma semana de exposição fetal) podem afetar a produção de oócitos saudáveis (Figura 1), interferindo durante seu crescimento dentro do ovário.1-3
O propósito dos estudos descritos abaixo foi demonstrar que a qualidade da água ultrapura (Tipo 1) obtida de um sistema de purificação Milli-Q® é adequada para preparar meios e soluções que garantam a ausência de BPA, especificamente, um ambiente de cultura livre de BPA para experiências de biologia reprodutiva.
- O Estudo 1mostra os resultados da análise de BPA em diferentes tipos de água usando microextração em fase sólida de alto desempenho acoplada à cromatografia gasosa e espectrometria de massa (HP-SPME-GC-MS).
- O Estudo 2 apresenta os resultados de análises citológicas e moleculares para avaliar o impacto do BPA na maturação dos oócitos.
- O Estudo 3 mostra a importância da água para os meios de cultura usados na tecnologia de imagem de células.
Figura 1.Análise imunocitoquímica microscópica de um oócito de camundongo durante o estágio meiótico da metáfase II (MII) usando anticorpos contra proteínas nos fusos meióticos (vermelho) e centrossomos (verde). Os cromossomos foram corados com corante de contraste DAPI (azul).
Estudo 1: HP-SPME-GC-MS para medir BPA em água ultrapura usada em pesquisas de embriologia
Na biologia reprodutiva, a água é um reagente essencial usado para realizar análises (por exemplo, preparação de meios de cultura).
Cientistas da Universidade de Pavia, na Itália, usaram um método HP-SPME-GC-MS reproduzível para analisar o conteúdo de BPA na água ultrapura usada em sua pesquisa embriológica. A água ultrapura analisada foi fornecida por um sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q® IQ 7000 alimentado por água pura Elix® produzida por um sistema que emprega uma combinação de tecnologias de purificação, incluindo osmose reversa avançada (RO), eletrodeionização Elix® (EDI) e uma lâmpada UV bactericida, semelhante a um sistema de água Milli-Q® HX. O sistema ultrapuro Milli-Q® IQ 7000 foi equipado com um polidor Biopak® no momento do uso (Figura 2). O polidor de ultrafiltração Biopak® é recomendado para aplicações de biologia molecular para fornecer água livre de endotoxinas, nucleases, proteases e bactérias.
Figura 2.Resumo da análise experimental do bisfenol A (BPA) em diferentes tipos de água de laboratório usando HP-SPME-GC-MS.
A análise HP-SPME-GC-MS mostrou que o BPA não era detectável na água pura Elix® nem na água ultrapura Milli-Q® usada para alimentar as experiências do laboratório, dentro de um limite de detecção (LOD) de 4 nM (Tabela 1).
Conforme mencionado, a água experimental foi obtida de um polidor Biopak®. A Figura 3 mostra um resultado típico obtido pela análise de três amostras de água dispensadas consecutivamente de um sistema Milli-Q® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak® no momento do uso. A repetitividade e a robustez da análise GC-MS, bem como as variações diárias de BPA, foram avaliadas de acordo com os procedimentos descritos na seção de materiais e métodos abaixo.
Os resultados demonstram que a qualidade da água ultrapura obtida com o sistema Milli-Q® IQ 7000 não contém BPA detectável (LOD = 4 nM). Em particular, a análise mostrou que o BPA não vaza do sistema para a água do produto, pois não foi detectado na água da torneira que alimenta o sistema de purificação de água.
Figura 3.Cromatogramas mostrando os níveis de BPA em três amostras de água ultrapura. As amostras foram retiradas consecutivamente no momento do uso de um sistema de água ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak®.
Os seguintes dois estudos revelam que um sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q® pode ser usado com confiança para dispensar água de alta qualidade sem contaminação por BPA e pode ser também usado no estudo dos efeitos dos desreguladores endócrinos no desenvolvimento de gametas e embriões, especialmente a água retirada após o polidor Biopak®.
Estudo 2: Água ultrapura sem BPA para análises citológicas e moleculares para avaliar o impacto do BPA na maturação dos oócitos
Ao medir o impacto de uma molécula específica, o ambiente experimental deve estar livre da molécula de interesse. No estudo apresentado, os cientistas usaram qRT-PCR para analisar a expressão de transcrição de quatro genes de efeito materno, Brg1 (remodelador de cromatina), Dnmt3a e Dnmt3l (metilases de DNA) e Oct-4 (marcador de pluripotência celular). As amostras consistiam em três grupos independentes de 10 oócitos de camundongo em metáfase II (MII), obtidos após 15 horas de maturação in vitro (IVM) de oócitos antrais totalmente crescidos na presença de 10 nM, 100 nM ou 1.000 nM de BPA.
Os resultados revelaram que o BPA não interrompeu a maturação meiótica nas três doses testadas, pois a grande maioria (96,5%) dos oócitos atingiu a fase MII, sem uma diferença significativa entre os controles (CTR) e as amostras expostas. No entanto, a expressão de todos os genes testados foi significativamente alterada (maior ou menor em comparação com o controle não tratado) em todas as concentrações de BPA testadas, exceto o Oct-4, que não foi alterado em 10 nM de BPA (Figura 4).
Essas experiências de expressão gênica foram realizadas com água ultrapura dispensada de um sistema de purificação de água Milli-Q® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak®. Os resultados confirmam a adequação da água ultrapura dispensada por esse sistema Milli-Q® para uso em aplicações sensíveis ao BPA na biologia reprodutiva.
Figura 4.Perfis de expressão dos genes de efeito materno Brg1, Dnmt3a, Dnmt3l e Oct-4 em oócitos de camundongo expostos a 10, 100 ou 1.000 nM de BPA durante a transição de GV para MII. Os valores de expressão das amostras de controle (CTR) foram definidos como 1 para o cálculo da alteração n-vezes. Os valores são expressos como média ± DP. *p < 0,05 **p < 0,001.
Estudo 3: Água ultrapura sem BPA para meios usados na tecnologia de imagem de células
As imagens de lapso de tempo nos permitem observar os movimentos que ocorrem dentro de um oócito durante sua transição da vesícula germinativa (GV) para a fase MII do desenvolvimento (vídeo4). Esses movimentos, conhecidos como Velocidade de Movimento Citoplasmático (CMV), servem como um marcador citológico não invasivo para avaliar a competência de desenvolvimento de um gameta feminino (a qualidade e a capacidade de um gameta de sustentar o desenvolvimento posterior).5,6 No estudo apresentado, essa nova técnica foi usada para investigar a CMV que ocorre durante a transição de GV para MII de oócitos amadurecidos na ausência ou na presença de concentrações crescentes de BPA (a Figura 5 mostra dados representativos apenas para 100 nM de BPA).
A análise de velocidade de imagem de partícula celular (Cell PIV) mostrou janelas de tempo de desenvolvimento específicas em que os oócitos eram sensíveis às doses de BPA testadas. Curiosamente, quando expostos à baixa concentração de 10 nM de BPA, as alterações na CMV foram dispersas em momentos únicos, enquanto que em doses mais altas, as alterações na CMV foram visíveis em um lapso de tempo prolongado durante a transição de GV para MI. Especificamente, o BPA 100 nM levou a diferenças significativas em um intervalo de tempo quando a cromatina se condensa e os centrômeros se agregam em grandes cromocentros para formar a placa MI (Figura 5).
O meio de cultura envolvido nas experiências com CMV acima foi preparado com água ultrapura fornecida por um sistema de purificação de água Milli-Q® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak®. Os resultados enfatizam a necessidade de meios de cultura livres de BPA, pois mesmo doses baixas de 100 nM de BPA podem ter efeitos, detectados por meio da análise da expressão gênica ou de movimentos citoplasmáticos.
Figura 5.(A) Imagens representativas de um oócito GV, tiradas no quadro 1 (a) e de um oócito MII no quadro 100 (b). As inserções mostram imagens ampliadas com setas (vetores de velocidade) indicando a intensidade e a direção dos movimentos citoplasmáticos. A cor e o comprimento das setas indicam o módulo de velocidade dos movimentos em comparação com o quadro anterior. Barra de escala vetorial colorida (nm/min): azul indica baixa velocidade; roxo indica alta velocidade. Barra: 10 μm. (B) Perfil de movimento citoplasmático durante a transição GV para MII de oócitos de camundongo na ausência (verde) ou presença (cinza) de 100 nM de BPA. *p < 0,05.
Conclusão: Água ultrapura para aplicações sensíveis ao BPA em estudos de embriogênese
A sensibilidade e o desempenho cada vez maiores das técnicas de pesquisa exigem água purificada de alta qualidade para evitar que a contaminação comprometa a precisão e a autenticidade dos resultados experimentais. Os cientistas precisam de água de alta pureza, especialmente em estudos que envolvam ferramentas de investigação de alta inovação, para evitar quaisquer adversidades que possam atrapalhar seus resultados (por exemplo, BPA, endotoxinas, nucleases, proteases e bactérias) e para aumentar a confiabilidade em suas análises experimentais.
No campo da embriologia, até mesmo níveis baixos do desregulador endócrino BPA demonstraram comprometer a pesquisa de embriogênese ao interferir no crescimento dos oócitos. Isso suscita inquietações porque o BPA, embora não esteja necessariamente presente na água da torneira de um laboratório, pode se infiltrar nos consumíveis e equipamentos do laboratório, causando interferências nos resultados experimentais.
Neste artigo, embora tenhamos demonstrado que baixos níveis de BPA não interromperam a maturação meiótica, uma concentração muito baixa de BPA de apenas 10 nM afetou a expressão gênica e os movimentos que ocorrem dentro de um oócito durante sua transição da vesícula germinativa (GV) para a fase MII do desenvolvimento. Esses resultados destacam a necessidade de realizar experiências de embriologia em um ambiente livre de BPA, incluindo o uso de água ultrapura com garantia de níveis não detectáveis de BPA.
Foi demonstrado que a água ultrapura fornecida por um sistema de purificação de água ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado com o polidor Biopak® não contém BPA detectável, em um limite de detecção muito baixo de apenas 4 nM, de acordo com o método usado neste estudo. A água ultrapura fornecida por esse sistema pode, portanto, ser usada com segurança para estudar os efeitos dos desreguladores endócrinos no desenvolvimento de gametas e embriões.
Para encontrar soluções para purificação de água adaptadas às necessidades de análises sensíveis ao BPA, solicite o apoio de um especialista em água para laboratório.
Materiais e métodos para a análise de BPA por HP-SPME-GC-MS
Instrumentos
- Um sistema GC-MS de quadrupolo único Thermo Scientific DSQII (espectrômetro de massa TraceDSQII, cromatógrafo a gás TraceGCUltra) equipado com um amostrador automático CombiPAL (CTC Analytics, Suíça) foi usado para realizar a análise da água.
- Foi usada uma coluna capilar Restek RxiTM - 5ms (5% difenil/95%ddimetil polissilano - Restek Corporation, Bellefonte, EUA) de 30 mm de comprimento, 0,25 I.D., 0,25 µm de espessura de filme, com hélio como gás condutor a uma taxa de fluxo constante de 1,0 ml/min.
- Foi usado um conjunto de fibras SPME de 100 µm de polidimetilsiloxano (PDMS). A fibra foi limpa antes de cada análise por 20 minutos no aquecedor de agulha a 250 °C para evitar a contaminação da análise anterior.
Preparação padrão
Uma solução de reserva de BPA com concentração de 10 nM foi preparada em etanol 100%. Foi realizada uma sequência de diluições para obter uma curva de calibração com quatro níveis de concentração diferentes, 1, 2, 4, 40 nmol/l, usando água HPLC.
Experiência 1: Avaliação da repetibilidade e robustez da análise GC-MS
Foram coletadas consecutivamente três amostras de água (5 ml) de cada uma das três fontes: água da torneira, água pura Elix® e no ponto de uso de um sistema de água ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak®. Antes da coleta, foram dispensados 5 l de água para enxaguar o sistema.
Experiência 2: Avaliação das variações diárias na concentração de BPA
Foram coletadas três amostras de água (5 ml) da água da torneira, água pura Elix® e no ponto de uso de um sistema de água ultrapura Milli-® IQ 7000 equipado com um polidor Biopak®, a cada 24 horas durante três dias. Antes da coleta, foram liberados 5 l de água. Estão disponíveis cromatogramas sob demanda.
Amostras de água
Foi adicionado um volume de 5 ml de água a ser analisada (referida como água da torneira, água pura Elix® e água ultrapura filtrada Biopak®) em frascos de vidro de 20 ml. Em cada frasco, foram adicionados 200 mg de KHCO3, 1 g de NaCl e uma barra de agitação magnética descartável.
Derivatização
Foram adicionados 30 µl de anidrido acético à amostra de água e os frascos foram vedados com uma tampa de alumínio com espaço livre e um septo revestido de politetrafluoretileno. Foi obtida uma reação completa com um tempo de reação de derivatização de 5 minutos a 80 °C (com agitação contínua a 50 rpm). A extração de BPA no espaço livre foi realizada com a fibra PDMS de 100 µm a 80 °C por 30 minutos com agitação (500 rpm). A fibra SPME foi dessorvida no injetor a 250 °C por 2 minutos.
Análise cromatográfica
A temperatura do forno foi mantida em 150 °C por 2 minutos, aumentada em 30 °C/min para 280 °C e mantida por 6 minutos. A injeção foi realizada no modo splitless, o tempo splitless foi de 2 minutos e a temperatura do injetor PTV foi mantida em 250 °C. A linha de transferência foi mantida a 290 °C e a fonte de íons a 250 °C. O MS foi operado no modo de ionização por impacto de elétrons (EI) e os íons foram registrados no modo de varredura completa, com uma faixa de massa de m/z 35-350 amu, e no modo SIM (monitoramento selecionado), usando o m/z 270 como íon quantificador para BPA.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao laboratório de biologia do desenvolvimento da Universidade de Pavia (Itália) pela realização deste estudo e aos nossos colegas de Pesquisa e Desenvolvimento por sua contribuição para este projeto.
Referências
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