Stratégies de fabrication pour les vaccins et les traitements à base d'ARNm
Grâce à des délais réduits entre le développement et les essais cliniques, la technologie de l'ARNm est prometteuse, non seulement en tant qu'outil rapide et efficace pour faire face aux épidémies de maladies infectieuses, mais aussi pour le développement de nouveaux traitements destinés à des maladies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. Les technologies de l'ARNm offrent de nombreux avantages : un excellent profil de sécurité, une grande polyvalence et un processus de fabrication étalonné.
Fort du succès précoce des vaccins à ARNm, les fabricants actuels cherchent à améliorer l'efficacité et la productivité de leurs processus de production en renforçant la stabilité de l'ARNm et en mettant en œuvre des stratégies qui optimisent la purification de l'ADNp et de l'ARNm, ainsi que la montée en puissance vers une production conforme aux BPF.
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Aperçu de la section
Considérations relatives à la fabrication d'ARNm
La fabrication des vaccins et des produits thérapeutiques à base d'ARNm suit généralement un processus étalon (figure 1). Ce modèle de fabrication simplifié utilise les mêmes réactifs pour toutes les cibles et permet aux fabricants d'ARNm de produire de nouvelles molécules cibles avec un minimum d'adaptations du processus.
Figure 1.Aperçu général du processus de fabrication de l'ARNm.
Plusieurs décisions clés ont un impact considérable sur le processus, le rendement et la qualité du produit final à base d’ARNm, et l’une d’entre elles concerne la qualité des produits chimiques et des matières premières utilisés. En particulier lors de la transcription in vitro et de la purification en aval, l’ARNm est exposé et présente un risque élevé de dégradation enzymatique. L’utilisation de produits chimiques de haute qualité, dont l’absence d’activité endonucléasique a été vérifiée, minimise le risque de dégradation induite par les RNases et améliore la stabilité de l’ARNm tout au long de la purification et de la formulation du médicament à base d’ARNm.
Cette page web vous aidera à relever ces défis et bien d'autres en vous fournissant des informations sur nos solutions complètes et intégrées, conçues pour rationaliser votre fabrication d'ARNm. Notre brochure « Produits chimiques de process pour la fabrication de médicaments à base d'ARNm » vous fournit les détails dont vous avez besoin pour faire des choix éclairés.
Figure 2.Structure de l'ARNm.
- Région cap à l'extrémité 5' de la séquence : essentielle à la maturation de l'ARNm, à sa reconnaissance par le ribosome pour une traduction protéique efficace, et à sa protection contre la digestion par les nucléases afin d'améliorer sa stabilité.
- Régions non traduites (UTR) situées en amont et en aval de la région codante de l'ARNm : régulent la traduction, la localisation et la stabilité de l'ARNm ; peuvent être utilisées pour améliorer l'efficacité de l'expression protéique.
- Cadre de lecture ouvert ou région de séquence codante : contient le gène d'intérêt (GOI).
- Queue poly(A) : essentielle pour la traduction des protéines et la stabilité de l'ARNm en empêchant la digestion par l'exonucléase 3'.
Fabrication d'ARNm
La production de médicaments et de vaccins à base d'ARNm commence par un matrice d'ADN plasmidique (pDNA) qui est ensuite linéarisée et transcrite en ARNm.
- Production de pDNA : Le matrice pDNA contient un promoteur de l'ARN polymérase dépendante de l'ADN et la séquence du construct d'ARNm. Le pDNA est amplifié dans des cellules bactériennes qui sont ensuite récoltées et lysées pour libérer le pDNA circulaire. Ce lysat est extrêmement visqueux car il contient le pDNA et d'autres impuretés de grande taille et chargées négativement, telles que l'ARN, l'ADN génomique et les endotoxines provenant des cellules bactériennes, ce qui rend la purification difficile.
- Purification de l'ADN plasmidique : la purification du matrice d'ADN plasmidique des impuretés doit maximiser la séparation tout en minimisant le risque de dommages mécaniques à la matrice plasmidique. L'ADN plasmidique circulaire purifié est ensuite linéarisé afin d'éviter les événements de lecture transcrizionale qui pourraient générer des variants indésirables de la séquence d'ARNm qu'il faudrait éliminer.1 Cette matrice d'ADN plasmidique linéarisée est ensuite purifiée davantage pour éliminer les impuretés telles que l'enzyme de restriction utilisée pour la linéarisation, l'albumine sérique bovine (BSA), les fragments d'ADN et les endotoxines. Comme la matrice d'ADN plasmidique est généralement produite dans des cellules bactériennes, les impuretés sous forme d'endotoxines constituent un problème critique qui affecte les étapes de purification suivantes. Des détergents tels que le Deviron® C16 peuvent être utilisés pour éliminer efficacement les endotoxines et constituent une alternative durable, biodégradable et conforme au règlement REACH aux détergents traditionnels.2
Il existe des différences marquées dans l'approche de la purification de l'ADNp à l'échelle du laboratoire et à l'échelle de production BPF. Les procédés à l'échelle du laboratoire utilisent souvent des techniques d'extraction par solvant pour séparer l'ADNp des autres composants, mais la manipulation et l'élimination de ces produits chimiques à grande échelle peuvent s'avérer difficiles. En revanche, les environnements de production BPF utilisent généralement la filtration tangentielle (TFF) et la chromatographie pour éliminer efficacement les impuretés.
Transcription in vitro (IVT) : L'ADN plasmidique linéarisé et purifié est ensuite transcrit en ARNm au cours d'une réaction enzymatique.
- Les composants essentiels à la transcription in vitro comprennent l'ARN polymérase, qui catalyse la transcription de l'ADN en ARNm ; les ribonucléosides triphosphates (rNTP), qui servent de blocs de construction de l'ARNm ; la pyrophosphatase inorganique (IPP), qui améliore le rendement en ARNm ; et les inhibiteurs de RNase, qui préviennent la dégradation de l'ARN. Le tampon de transcription contient généralement du dithiothréitol (DTT) pour réduire les liaisons disulfure et inhiber l'activité RNase, tandis que la spermidine est ajoutée pour améliorer l'efficacité de la transcription et stabiliser les acides nucléiques. Afin de minimiser le risque de dégradation enzymatique au cours de cette étape critique du processus, il est essentiel de sélectionner des produits chimiques dont l'absence d'activité endonucléase a été vérifiée. Pour un aperçu complet de nos produits chimiques et excipients de haute qualité, y compris une large gamme de produits sans endonucléase, consultez notre brochure « Produits chimiques de process pour la fabrication de médicaments à base d'ARNm ».
- Surveillance de la transcription : les paramètres critiques du processus (CPP) doivent être surveillés pendant la réaction IVT afin de contrôler les attributs de qualité critiques (CQA) et d'assurer un traitement optimal. Une surveillance efficace permet une fabrication mieux contrôlée et des réponses plus rapides à la variabilité du processus.
Capotage : après la transcription, une structure de capotage 5' est ajoutée au transcrit d'ARNm afin d'améliorer la stabilité et la transduction dans la cellule hôte. Le capotage peut être ajouté de deux manières :
- Capotage co-transcriptionnel : réalisé pendant l'étape IVT. Cependant, l'efficacité et le rendement sont faibles, et cette approche peut générer des impuretés non capotées en raison d'une liaison incorrecte ou d'une incorporation inverse.
- Le coiffage enzymatique (ou coiffage post-transcriptionnel) est réalisé après la purification de l'ARNm. Cette approche utilise généralement une enzyme de coiffage pour ajouter la coiffe à l'ARNm purifié. Bien que cette approche soit plus efficace, elle est plus coûteuse et constitue une étape de traitement supplémentaire après la purification.
Purification de l'ARNm
Après la transcription in vitro, l'ARNm est purifié des impuretés et des matériaux utilisés lors des étapes précédentes, notamment les endotoxines, l'ARN double brin (ARNdb) immunogène, les résidus de matrice d'ADN, l'ARN polymérase et les impuretés élémentaires. Plusieurs options sont disponibles pour la purification de l'ARNm et l'élimination des résidus d'ADN.
La séparation chromatographique, telle que la chromatographie en phase inverse sur colonne à paires d'ions (IPRP), l'échange d'anions (AEX) et la chromatographie d'affinité (AC) utilisant la capture par poly(dT) (Figure 3), permet de purifier efficacement l'ARNm cible et d'éliminer la matrice d'ADN, rendant ainsi inutile la digestion de l'ADN1, 3. La chromatographie est également utilisée après le coiffage enzymatique pour éliminer les transcrits d'ARNm indésirables et les impuretés oligonucléotidiques.
Figure 3 :Comparaison entre la chromatographie en phase inverse à paires d'ions, la chromatographie d'échange d'anions et la chromatographie d'affinité pour la purification de l'ARNm (DBC : capacité de liaison dynamique).4,5
- La chromatographie par appariement ionique en phase inverse (IPRP) peut être utilisée à petite échelle pour capturer efficacement l'ARN simple brin (ssRNA) cible et le séparer des impuretés. Cependant, comme cette méthode nécessite des solvants, elle est moins adaptée à la fabrication conforme aux BPF et convient mieux au raffinage qu'à la capture.
- La chromatographie par échange d'anions (AEX) possède une capacité de liaison dynamique élevée et élimine efficacement les impuretés telles que l'ARN double brin (dsRNA), l'ARN non coiffé, les hybrides ARN-ADN et d'autres structures d'ARN telles que l'ARNm en épingle à cheveux. Bien que l'AEX utilise des solutions aqueuses, elle nécessite des agents chaotropiques potentiellement toxiques et des températures de fonctionnement pouvant atteindre 85 °C pour désorber les grosses molécules d'ARNm liées à la résine.
- La chromatographie d'affinité (AC) avec capture par poly(dT) utilise une résine pour capturer spécifiquement la queue poly(A) des transcrits d'ARNm pleine longueur. Cette méthode élimine efficacement l'ADN, les nucléotides, les enzymes, les composants du tampon et toute autre impureté ne possédant pas de queue poly(A). C'est pourquoi l'AC est couramment utilisée pour la capture initiale de l'ARNm, suivie d'une AEX pour le polissage.
- La concentration finale et la diafiltration sont effectuées après la ou les étapes de chromatographie afin de maximiser la pureté du produit et de transférer l'ARNm dans le tampon approprié pour la formulation ou le stockage.
Considérations relatives à la mise à l'échelle
Les technologies à usage unique offrent évolutivité, adaptabilité et qualité aux fabricants disposant d'un vaste pipeline de cibles et constituent un facteur clé pour de nombreux procédés de fabrication d'ARNm conformes aux BPF. La fabrication conforme aux BPF tire parti des avantages des étapes de TFF ou de chromatographie pour une séparation efficace à grande échelle, remplaçant ainsi les méthodes de purification alternatives typiques du développement de procédés à petite échelle. Les considérations à garder à l'esprit sont les suivantes :
- Les étapes de TFF ou de chromatographie remplacent les étapes d'extraction par solvant et de précipitation fréquemment utilisées dans le développement des procédés d'ARNm.
- Des produits chimiques de haute qualité et des réactifs exempts d'endonucléases doivent être utilisés dans la mesure du possible afin d'améliorer la stabilité de l'ARNm et de minimiser le risque de dégradation de l'ARNm.
Ces dernières années ont été marquées par des succès majeurs dans le déploiement de vaccins à ARNm auprès de larges populations de patients. Bien que des défis subsistent, l'accent mis sur la maximisation de la stabilité de l'ARNm grâce à l'utilisation de produits chimiques de haute qualité et de réactifs exempts d'endonucléases, ainsi que l'optimisation et l'adaptation des technologies de purification chromatographique pour maximiser la séparation et rationaliser la mise à l'échelle, ont permis des progrès majeurs dans les modèles de fabrication conforme aux BPF.
Pour que la technologie de l'ARNm atteigne son plein potentiel, il faudra faire appel à des solutions innovantes, à une expertise pointue et à une grande ingéniosité afin de garantir le développement de plateformes robustes à l'échelle industrielle. Grâce à nos produits, nos services et notre expertise technique, nous nous engageons à développer des solutions intégrées visant à rationaliser votre processus de fabrication d'ARNm.
Références
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