Probenreinigung

Einige der folgenden gängigsten Reinigungsverfahren werden im Labor zur Aufbereitung von Proben für die nachfolgende Analyse eingesetzt.

Dialyse

Die Dialyse ist eine Reinigungstechnik, die dazu dient, Salz oder andere Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht aus einer Probe zu entfernen. Sie wird auch verwendet, um die Pufferzusammensetzung einer Probe auszutauschen. Die Dialyse ist eine passive Technik, die große Mengen an Puffer erfordert.

Pufferaustausch und Entsalzung

Die Entsalzung ist eine einfache Methode, um Salze und andere niedermolekulare Verunreinigungen aus einer Probe zu entfernen. Sie wird auch für den Pufferaustausch vor oder nach verschiedenen chromatographischen Schritten sowie für die schnelle Entfernung von Reagenzien zur Beendigung einer Reaktion eingesetzt.

Fraktionierte Präzipitation

Die fraktionierte Präzipitation wird eingesetzt, um grobe Verunreinigungen aus kleinen Probenvolumina zu entfernen. Präzipitationstechniken trennen Fraktionen nach dem Prinzip der differentiellen Löslichkeit. Da sich Proteine in ihrem Grad an Hydrophobie unterscheiden, können erhöhte Salzkonzentrationen die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Proteinen verstärken und eine Präzipitation bewirken.

Extraktion

Die Probenvorbereitung durch Extraktion umfasst die Isolierung von Zielanalyten aus einer komplexen Probe oder einem viel größeren Probenvolumen. Der Prozess entfernt störende Probenkomponenten, die HPLC- und GC-Säulen verstopfen könnten. Außerdem erhöht er die Analytkonzentration um den Faktor 100 bis 5.000 und verbessert dadurch die Nachweisempfindlichkeit erheblich. Als Teil einer selektiven und spezifischen Probenvorbereitung trägt die Extraktion dazu bei, eine zuverlässigere chromatographische Analyse zu gewährleisten. Zu den Extraktionsarten gehören die Flüssig-Flüssig-Extraktion, die Festphasenextraktion (SPE) und die Festphasen-Mikroextraktion (SPME).

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie trennt Proteine auf der Grundlage reversibler Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem spezifischen Liganden, der an eine Chromatographiematrix gekoppelt wurde. Die Technik ist hochselektiv und ermöglicht eine Proteinreinigung mit hoher Kapazität. Die Affinitätschromatographie kann immer dann eingesetzt werden, wenn ein geeigneter Ligand für das betreffende Protein verfügbar ist.

Die Reinigung mittels Affinitätschromatographie umfasst Bindungs- und Elutionsschritte. In der Bindungsphase wird das Zielprotein spezifisch und reversibel an einen komplementären Liganden gebunden, der auf einer Chromatographiematrix immobilisiert wurde. Das Ziel besteht darin, das Zielprodukt zu isolieren, zu konzentrieren und zu stabilisieren, wobei seine Wirksamkeit und Aktivität erhalten bleiben. Nach dem Waschen der Matrix zur Entfernung ungebundener Substanzen wird das gebundene Zielprotein durch Änderung der Bedingungen in Richtung einer Elution zurückgewonnen. Die Elution erfolgt spezifisch unter Verwendung eines kompetitiven Liganden oder unspezifisch durch Änderung des pH-Werts, der Ionenstärke oder der Polarität. Durch die Elution kann das Zielprotein in gereinigter und konzentrierter Form gewonnen werden.