Merck

Probenaufreinigung

Diagramm zur Veranschaulichung der wichtigsten Phasen der Trennung in der Affinitätschromatographie mit den Schritten Binden, Waschen und Eluieren.

Es können verschiedene chemische und physikalische Aufreinigungsmethoden angewendet werden, um einen Zielanalyten vor der Analyse zu trennen oder zu konzentrieren. Dazu gehören u.a. Absorption, Adsorption, Chromatographie, Destillation, Extraktion, Ionenaustausch, Filtration, Komplexbildung, Kristallisation, Trocknung und viele mehr. Die Probenvorbereitung vor der Analyse dient dazu, die Probe in ein Format zu bringen, das mit der Analysetechnik kompatibel ist, die Komplexität der Probe zu reduzieren, interferierende Verunreinigungen zu entfernen und den Analyten vor der Analyse zu konzentrieren. Eine geeignete Probenvorbereitung verhindert Verstopfungen, kann die Notwendigkeit strenger Waschverfahren reduzieren und die Lebensdauer des chromatographischen Mediums verlängern.


Zugehörige technische Artikel

  • Substances are said to be miscible in one another if they dissolve to form a uniform solution. Bookmark or download our miscibility table for common lab solvents.
  • This page shows how to separate proteins and peptides with affinity for metal ions by immobilized metal chelate affinity chromatography using HiTrap Chelating HP, Chelating Sepharose Fast Flow,His MicroSpin Purification Module or HisTrap Kit from Cytiva.
  • This page shows volatile and non-volatile buffer suggestions for anion and cation exchange chromatography.
  • Ion exchange chromatography is employed by the Genopure Plasmid Midi Kit and the Genopure Plasmid Maxi Kit.
  • Affinitätschromatografie ist der Prozess der bioselektiven Adsorption an und der anschließenden Rückgewinnung einer Verbindung von einem immobilisierten Liganden. Dieses Verfahren ermöglicht eine hochgradig spezifische und effiziente Aufreinigung vieler verschiedener Proteine und anderer Verbindungen. Das Verfahren erfordert die Nutzung eines entsprechend selektiven Liganden, der die gewünschte Verbindung allgemein mit einer Dissoziationskonstante im Bereich von 10-4 bis 10-8 bindet und eine Rückgewinnung unter milden Bedingungen ermöglicht. Der Ligand wird allgemein auf einer kugelförmigen und porösen Matrix, die in Form einer Säulenpackung oder einem absatzweisen Adsorptionsmedium vorliegt, immobilisiert.
  • Alle anzeigen

Zugehörige Protokolle


Einige der folgenden, häufig eingesetzten Aufreinigungstechniken werden im Labor verwendet, um Proben für die nachgeschaltete Analyse vorzubereiten.

Dialyse

Die Dialyse ist eine Aufreinigungstechnik, die zur Entfernung von Salz oder anderen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht aus einer Probe verwendet wird. Sie wird auch verwendet, um die Pufferzusammensetzung einer Probe auszutauschen. Die Dialyse ist ein passives Verfahren, für das große Puffermengen benötigt werden.

Pufferaustausch & Entsalzung

Die Entsalzung ist eine einfache Methode zur Entfernung von Salzen und anderen niedermolekularen Verunreinigungen aus einer Probe. Sie wird auch für den Pufferaustausch vor oder nach verschiedenen chromatographischen Schritten und für die schnelle Entfernung von Reagenzien zum Beenden einer Reaktion verwendet.

Fraktionierte Fällung

Die fraktionierte Fällung wird verwendet, um grobe Verunreinigungen aus kleinen Probenmengen zu entfernen. In Fällungstechniken werden Fraktionen anhand der unterschiedlichen Löslichkeit getrennt. Da sich Proteine in ihrem Grad der Hydrophobie unterscheiden, können erhöhte Salzkonzentrationen die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Proteinen verstärken und Ausfällungen verursachen.

Extraktion

Die Probenvorbereitung durch Extraktion umfasst die Isolierung von Zielanalyten aus einer komplexen Probe oder einem sehr viel größeren Probenvolumen. In diesem Prozess werden interferierende Probenbestandteile entfernt, die HPLC- und GC-Säulen blockieren können. Außerdem wird die Analytenkonzentration um einen Faktor zwischen 100 und 5000 erhöht, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbessert wird. Als Teil einer selektiven und spezifischen Probenvorbereitung ermöglicht die Extraktion eine zuverlässigere chromatographische Analyse. Zu den Extraktionsarten gehören die Flüssig-Flüssig-Extraktion, die Festphasenextraktion (SPE) und die Festphasenmikroextraktion (SPME).

Affinitätschromatographie

In der Affinitätschromatographie werden Proteine auf Basis reversibler Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem spezifischen Liganden, der an eine Chromatographiematrix gekoppelt wurde, getrennt. Die Technik ist hochselektiv und ermöglicht eine Proteinaufreinigung mit hoher Kapazität. Die Affinitätschromatographie kann immer dann eingesetzt werden, wenn ein geeigneter Ligand für das Zielprotein verfügbar ist.

Die Aufreinigung durch Affinitätschromatographie umfasst Bindungs- und Elutionsschritte. In der Bindungsphase wird das Zielprotein spezifisch und reversibel an einen komplementären Liganden gebunden, der auf einer Chromatographiematrix immobilisiert wurde. Ziel ist es, das Zielprodukt zu isolieren, zu konzentrieren und zu stabilisieren, wobei Wirksamkeit und Aktivität erhalten bleiben. Nach dem Waschen der Matrix zur Entfernung ungebundenen Materials wird das gebundene Zielprotein zurückgewonnen, indem die Bedingungen so verändert werden, dass die Elution begünstigt wird. Die Elution erfolgt spezifisch mit einem kompetitiven Liganden oder unspezifisch durch Änderung des pH-Werts, der Ionenstärke oder der Polarität. Durch die Elution kann das Zielprotein in einer gereinigten und konzentrierten Form gesammelt werden.