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Zellwachstum & -erhaltung

Proliferierende Zellen im Auge eines E4 Hühnerembryos mittels BrdU-Färbung

Die Zellkultur ist eine grundlegende Technik, die in der biowissenschaftlichen Forschung eingesetzt wird, um relevante biologische Modelle zu erstellen oder rekombinante Proteine, Viruspartikel oder biologische Therapien herzustellen. Das Wachstum und die Erhaltung von kultivierten Zellen wie Bakterien, Hefen und Säugerzellen erfolgt in einer biologischen Sicherheitswerkbank (oft als Zell- oder Gewebekulturhaube bezeichnet) unter Verwendung geeigneter steriler Techniken, um eine mikrobielle und chemische Kontamination zu verhindern.

Zellkulturarten

Zwei der bekanntesten Ansätze für die Zellkultur bei Säugetieren sind die Primärkultur und die kontinuierliche Kultur. Primärkulturen werden direkt aus menschlichem oder tierischem Gewebe gewonnen und haben eine begrenzte Lebensdauer in der Kultur, die durch die zelluläre Seneszenz begrenzt ist. Kontinuierliche Kulturen gelten in Kultur als "unsterblich", da sie häufig aus Krebsgewebe von Patienten gewonnen werden. Zelllinien können auch durch Immortalisierung von Zellen erzeugt werden und können seriell vermehrt oder für zahlreiche Zellteilungszyklen bzw. unbegrenzt passagiert werden.


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Verwandte Protokolle


Erhaltung und Proliferation von Zellen in Kultur

Zellen können in Suspension oder als 2D-Monolayer kultiviert werden, der an der Gewebekulturflasche oder Multiwell-Platte anhaftet. Die Kulturmethode wird durch das Ursprungsgewebe der Zellen bestimmt; Zellen aus Blut wachsen im Allgemeinen in Suspension, während Zellen aus festem Gewebe in der Regel in Monolayern wachsen.

Bei 3D-Zellkulturmodellen (Organoiden und Sphäroiden) wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass sie die In-vivo-Umgebung der Zellen besser nachahmen als Zellen, die auf 2D-Oberflächen gezüchtet werden. Sphäroide werden häufig aus Krebszelllinien oder Tumorbiopsien (patient-derived xenografts oder PDX) als frei schwebende Zellaggregate in Platten mit ultraniedriger Anhaftung gebildet, während Organoide üblicherweise aus Gewebestammzellen gewonnen werden, die in eine ECM-Hydrogelmatrix eingebettet und dann differenziert werden.

Phasen des Zellwachstums

Die Gewährleistung eines angemessenen Zellwachstums ist entscheidend für die Erfassung genauer Daten aus Zellkulturstudien. Die Zellzahl kann mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler bestimmt werden, der genauere Zellzahlen liefert.

Das Zellwachstum in der Kultur verläuft im Allgemeinen in vier Phasen:

  1. Anlaufphase (Lag) - Die Zellen passen sich an die Kulturbedingungen an und teilen sich nicht.
  2. Exponentielle Phase (Log) - Die Zellen teilen sich aktiv, sodass dies die beste Phase ist, um das Populationswachstum zu bewerten oder Daten zu sammeln. Die späte Log-Phase ist der beste Zeitpunkt für die Passage (Subkultur) von Zellen.
  3. Stationäre Phase - Das Wachstum verlangsamt sich, wenn sich die Zellen der 100%igen Konfluenz nähern, und die Zellen sind am anfälligsten für Stress oder Verletzungen, da sich zelluläre Abfälle ansammeln und die Ressourcen erschöpft sind.
  4. Absterbephase - Die Population der lebenden Zellen nimmt ab, da der Zelltod überwiegt.

Zellkulturmedien, Supplemente und Reagenzien

Gezüchtete Zellen benötigen für ihr Wachstum eine Versorgung mit Nährstoffen. Säugerzellkulturmedien müssen den physiologischen pH-Wert aufrechterhalten und darüber hinaus ausgewogene Salze, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren und Lipide, Proteine und Peptide, Spurenelemente und Wachstumsfaktoren enthalten. Fötales Rinderserum (FBS) ist der am häufigsten verwendete Wachstumszusatz für die Zellkultur von Säugetieren, da es viele dieser wesentlichen Zellnährstoffe enthält und nachweislich das Wachstum von Zellen und Geweben in der Kultur fördert. Für Anwendungen, die definierte Medien oder reduzierte tierische Bestandteile erfordern, bieten xenofreie Medienformulierungen tierversuchsfreie Formulierungen mit bekannter Zusammensetzung.

Da Medien und Supplemente oft reichhaltige Nährstoffe für das Wachstum opportunistischer Mikroben liefern, erfordert eine erfolgreiche Zellkultur aseptische Techniken und eine regelmäßige Beobachtung, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind, die zum Zelltod führen oder das in-vivo-ähnliche Wachstum beeinträchtigen können. Bei häufig auftretenden mikrobiellen Verunreinigungen, die mikroskopisch nicht beobachtet werden können, schützt ein Routine-Screening mit Reagenzien zum Nachweis von Mykoplasmen die Kulturen und die Umgebung der Gewebevermehrung.

Hefekulturen wie S. cerevisiae und P. pastoris (Pichia) werden in der Forschung häufig für die Expression rekombinanter Proteine und die Untersuchung von Genfunktionen verwendet. Wichtige Nährstoffe, die in der Regel in einem Hefenährboden enthalten sind, sind Pepton, Hefeextrakt und Dextrose oder Glukose.

Zellkulturumgebungen und Kulturgefäße

Für die Kultivierung und Handhabung von Zellen werden sterile Einweg-Plastikbehälter verwendet, darunter Gewebekulturflaschen und Multiwell-Platten, serologische Pipetten, sterile Flaschenaufsatzfilter und sterile Spritzenvorsatzfilter. Gewebekulturflaschen und -platten aus Kunststoff werden in der Regel so behandelt, dass sie eine hydrophile Oberfläche aufweisen, die das Anhaften von adhärenten Zellen erleichtert. Als Alternative zu 2D-Oberflächen bieten Platten auf Basis mikroporöser Membranen eine physiologischere Wachstumsumgebung für komplexe Zellassays wie Zellmigration, Zell-Zell-Kommunikation und Zellpolarisation.

Die kultivierten Zellen müssen bei einer Temperatur und in einer Gasumgebung gehalten werden, die diese Parameter entsprechend dem Organismus, aus dem sie stammen, nachbilden. Kulturgefäße, die Zellen und Medien enthalten, werden in der Regel in Inkubationsgeräten aufbewahrt, die eine genaue Kontrolle der Temperatur und der Gasgemische ermöglichen. Kleine Tisch-Inkubationssysteme, die Mikrofluidik einsetzen und die Bildgebung von Zellen in ununterbrochener Kultur ermöglichen, können jedoch die authentischsten Umgebungen für prädiktive In-vitro-Modelle bieten.