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Mykoplasmen-Nachweis in der Pharmaindustrie

Die Kontamination mit Mykoplasmen ist ein weit verbreitetes und immer wiederkehrendes Problem in vielen Zellkultursystemen in der biowissenschaftlichen Forschung und der pharmazeutischen Industrie. Mykoplasmen können in Nährmedien hohe Titer erreichen, ohne typische Anzeichen einer bakteriellen Kontamination wie Trübung aufzuweisen. Sie können unterschiedliche Auswirkungen auf kultivierte Zellen haben, wie z. B. Stoffwechselveränderungen, verlangsamte Proliferation und Chromosomenaberrationen. Kurz gesagt, eine Mykoplasmen-Kontamination kompromittiert die Gültigkeit der Daten betroffener Zelllinien und die Ergebnisse für die Life-Science-Forschung. Der Mykoplasmen-Nachweis und die Haltung kontaminationsfreier Zellkulturen ist daher eine grundlegende Anforderung für die zellbasierte Forschung und die Herstellung von Produkten, damit die Verbrauchergesundheit im Mittelpunkt steht.


    Über Mykoplasmen-Bakterien

    Mykoplasmen gehören zu den kleinsten bekannten Bakterien und können Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm passieren. Diese Mikroorganismen wachsen aerob oder unter fakultativ anaeroben Bedingungen.

    Mykoplasmen sind entweder parasitisch oder saprophytisch. Verschiedene Arten, z. B. M. pneumoniae, sind pathogen und verursachen beim Menschen Lungenentzündungen und andere Atemwegserkrankungen. Es wird angenommen, dass M. genitalium an entzündlichen Erkrankungen des Beckens beteiligt ist. Mykoplasmen sind Bakterien, die keine Zellwand besitzen, und sind daher gegenüber Penicillinen und ähnlich wirkenden Antibiotika unempfindlich. Zur Stabilisierung ihrer Zytoplasmenmembranen benötigen die meisten Mykoplasmen Sterine, die sie in der Regel als Cholesterin aus ihren tierischen Wirten aus ihrer Umgebung aufnehmen. Viele Mycoplasmen-Stämme sind auch gegenüber einer Reihe anderer Antibiotika tolerant.

    Quellen der Mykoplasmen-Kontamination

    Die Ursachen von Mykoplasmen-Kontaminationen im Labor und in der Herstellung sind äußerst schwer zu kontrollieren. Einige Mykoplasmenspezies sind auf der menschlichen Haut zu finden und können durch mangelhafte aseptische Arbeitsweisen in Kulturen gelangen. Mykoplasmen können auch über kontaminierte Supplemente wie fötales Rinderserum eingeschleppt werden. Am häufigsten werden sie jedoch aus anderen kontaminierten Zellkulturen übertragen. Wenn Mykoplasmen einmal in Zellkulturen vorhanden sind, können sich diese Mikroben schnell ausbreiten und andere Laborbereiche durch Aerosole und Partikel kontaminieren, die bei der Handhabung von Kulturen erzeugt werden. Die strikte Einhaltung guter aseptischer Laborpraktiken ist entscheidend und Routineuntersuchungen von Kulturen werden für die erfolgreiche Kontrolle einer Mykoplasmenkontamination in Produktionsbereichen dringend empfohlen.

    Warum Mykoplasmen-Nachweise in der pharmazeutischen Industrie?

    Biopharmazeutische Einrichtungen, die eukaryotische Zellen für die Herstellung von Impfstoffen verwenden, müssen ihre Zellbanken und Saatvirenchargen sowie Bulk-Impfstoffe auf eine Kontamination mit Mykoplasmen untersuchen. Arten dieser Bakteriengattung infizieren eukaryotische Zellen und stören deren Wachstum und Stoffwechsel. Wenn Mykoplasmen die Impfstoffproduktion beeinträchtigen, kann dies die Proteinqualität und -ausbeute beeinträchtigen und, was noch wichtiger ist, Nebenwirkungen bei Patienten verursachen, denen das endgültige Impfstoffprodukt verabreicht wird.

    Die Kontamination eines Bioreaktors mit Mykoplasmen kann zu erheblichen Zeit-, Material- und Ertragsverlusten führen, es sei denn, sie wird frühzeitig im Produktionsprozess erkannt. Ohne strenge Prüfroutinen ist eine Mykoplasmen-Kontamination von biopharmazeutischen Produktionschargen äußerst schwierig zu entdecken, da das Vorhandensein von Mykoplasmen im Allgemeinen nicht zu pH-Veränderungen oder einer sichtbaren Trübung der Nährmedien führt. Die kompendiale Mykoplasmen-Nachweismethode umfasst sowohl Kultur- als auch Indikatorzellentests für den Nachweis. Wenn nur zwei Medien für die Analyse verwendet werden, empfiehlt es sich, die Medien FREY und FRIIS in Kombination zu verwenden.

    Mykoplasmen-Nachweismethoden

    Es ist daher wichtig, Biopharmaka, Impfstoffe, Zell- und Viruskulturen an verschiedenen Punkten der Qualitätskontrolle auf Mykoplasmen zu testen. Die drei gebräuchlichsten Nachweismethoden sind:

    • Mykoplasmen-Kultur, wobei für Mykoplasmen optimierte bakterielle Nährmedien mit Testproben beimpft werden
    • DNA-Färbemethoden, wobei Mykoplasmenkerne mit Hoechst oder DAPI gegengefärbt und mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden
    • PCR (Polymerasekettenreaktion) zur Amplifikation der Bakterien-DNA, falls Mykoplasmen in Proben vorhanden sind

    Arbeitsablauf zum Nachweis von Mykoplasmen gemäß EP 2.6.7 & USP 63

    * An den Tagen nach der Inokulation wird jedes flüssige Medium subkultiviert, indem 0,2 ml auf mindestens eine Platte jedes festen Mediums aufgebracht werden. Wiederholen Sie den Vorgang zwischen dem 6. und 8. Tag, zwischen dem 13. und 15. Tag und zwischen dem 19. und 21. Tag des Tests. Beobachten Sie das flüssige Medium alle 2 oder 3 Tage und subkultivieren Sie es, wenn eine Farbänderung auftritt. Hinweis: Darüber hinaus sind eine Positiv- und eine Negativkontrolle pro festem und flüssigem Medium erforderlich, wobei die Inkubationszeit 14 Tage beträgt.

    * An den Tagen nach der Inokulation wird jedes flüssige Medium subkultiviert, indem 0,2 ml auf mindestens eine Platte jedes festen Mediums aufgebracht werden. Wiederholen Sie das Verfahren zwischen dem 6. und 8. Tag, zwischen dem 13. und 15. Tag und zwischen dem 19. und 21. Testtag. Beobachten Sie das flüssige Medium alle 2 oder 3 Tage und subkultivieren Sie es, wenn eine Farbänderung auftritt.
    Hinweis: Darüber hinaus sind eine Positiv- und eine Negativkontrolle pro festem und flüssigem Medium erforderlich, wobei die Inkubationszeit 14 Tage beträgt.

    Gebrauchsfertige Medien für den kompendialen Mykoplasmen-Nachweis

    Wir bieten ein vollständiges Portfolio gebrauchsfertiger Nährlösungen und Nährböden, die für den Nachweis von Mykoplasmen gemäß Europäischem Arzneibuch 6.1 (2.6.7.) und USP 35 (63) benötigt werden. Ohne weitere Aufbereitungsschritte werden durch unsere gebrauchsfertigen Mykoplasmen-Nährmedien eine gleichbleibende Produktqualität und eine vollständige Rückverfolgbarkeit mit chargenspezifischen Analysenzertifikaten sichergestellt.

    Aufgrund ihrer Inhaltsstoffe haben Mykoplasmen-Medien für die mikrobiologische Qualitätskontrolle im Allgemeinen eine weitaus kürzere Haltbarkeit als die meisten anderen Nährmedien. Die Haltbarkeitsdauer unserer gebrauchsfertigen Friis, Frey und Hayflick flüssigen und festen Medien wurde auf 4 Monate für die Agarplatten und 6 Monate für die Bouillons verlängert. Erleben Sie unser vollständiges Sortiment an gebrauchsfertigen Nährmedien mit längerer Haltbarkeit, um den Mykoplasmen-Nachweis zu erleichtern.






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