Merck

HPLC-Puffer

Anhäufung von Puffersalzkristallen

Puffer sind Lösungen einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base oder einer schwachen Base und ihrer konjugierten Säure. In der analytischen Chemie werden Puffer üblicherweise in der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) verwendet, wenn die Probe saure oder basische funktionelle Gruppen enthält. Puffer mildern den Einfluss von Wasserstoff-/Hydronium- und Hydroxidionen und reduzieren so pH-Schwankungen.



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Mobile Phase Puffer

Die richtige Wahl des Puffers ist im Hinblick auf Pufferspezies, Ionenstärke und pH-Wert der wichtigste Schritt bei der RP-HPLC-Methodenentwicklung für ionische Analyten. Die Retention von ionischen Analyten wird in der RP-HPLC grundlegend durch den pH-Wert der mobilen Phase beeinflusst. Daher ist die Kontrolle des pH-Werts der mobilen Phase in der RP-HPLC einer der wichtigsten Parameter für eine effektive Analytentrennung.

Der typische pH-Bereich für Umkehrphasentrennungen in Säulen auf Kieselgelbasis liegt zwischen 2 und 8. Der Puffer muss einen pKa nahe dem gewünschten pH-Wert haben, da der pH-Wert von Puffern am besten an ihrem pKa-Wert kontrolliert werden kann. Als Faustregel gilt, dass es ideal ist, einen Puffer mit einem pKa-Wert < 2 Einheiten des gewünschten pH-Werts der mobilen Phase zu wählen. Wir bieten HPLC-Puffer für einen breiten pH-Bereich für alle Anforderungen in der Laborchromatographie an.

Faktoren, die bei der Auswahl eines HPLC-Puffers zu berücksichtigen sind

Chemische Reinheit

Die Qualität der in einem HPLC-Experiment verwendeten Additive der mobilen Phase (Puffer, Salze, Säuren und Basen) sowie der organischen Lösungsmittel muss an die Empfindlichkeit des Detektors und das Elutionsprotokoll angepasst werden. Für eine optimale Chromatographie werden qualitativ hochwertige Lösungsmittel und Reagenzien empfohlen.

Chemische Kompatibilität

Die Pufferzusammensetzung muss zusammen mit dem pH-Wert der mobilen Phase passend zum Material des Säulengehäuses und der Art der stationären Phase gewählt werden. Dies verhindert Schäden an den Komponenten der Säule und am Säulenbett.

Pufferlöslichkeit

Im Idealfall soll der Puffer vollständig wasserlöslich sein und nicht präzipitieren. Die Pufferkonzentration muss sorgfältig gewählt werden, um eine Präzipitation bei höheren Konzentrationen zu vermeiden, wenn der Puffer mit dem organischen Lösungsmittel gemischt wird. Wenn dies nicht berücksichtigt wird, kann es zu Betriebsproblemen in den Pumpen kommen und in einer Verstopfung der HPLC-Säule resultieren.

Pufferstärke

Ein Eluent, der eine schwache Wechselwirkung mit der stationären Phase zeigt, ist nur in der Lage, schwach gebundene Analyten von der Säule zu eluieren, wohingegen eine starke Wechselwirkung die Elution stark gebundener Probenmoleküle bewirkt. Die Elutions- oder Lösungsmittelstärke verschiedener Lösungsmittel hängt von der Art der verwendeten stationären Phase ab. Neben der Elutionsstärke spielen die Viskosität und die UV-Absorbanz des Puffers eine wichtige Rolle im Hinblick auf ihre Eignung für den Einsatz in HPLC-Analysen.