Standard PCR-Protokoll

Wie man eine PCR durchführt

Ein Standardaufbau einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) besteht aus vier Schritten:

1. Die erforderlichen Reagenzien oder Mastermix und Template in PCR-Gefäße geben.
2. Mischen und zentrifugieren.
   *Mineralöl hinzufügen, um Verdunstung in einem Thermocycler ohne beheizten Deckel zu verhindern.
3. Amplifizieren gemäß Thermocycler- und Primer-Parametern.
4. Auswerten der amplifizierten DNA durch Agarosegel-Elektrophorese und anschließende Ethidiumbromid-Färbung.

Diese Schritte werden im Folgenden zusammen mit Tipps zur Auswahl von Materialien und Reagenzien ausführlicher dargestellt. Dies ist ein grundlegendes PCR-Protokoll unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase.

PCR-Schritte und wesentliche PCR-Komponenten

Bei der Fehlersuche in einer PCR-Reaktion spielen viele Faktoren eine Rolle. Sehen Sie sich diese Animation an, um zu erfahren, wie die Auswahl der richtigen Komponenten und Zyklusbedingungen für Ihre Bedürfnisse zu optimalen Ergebnissen führen kann.

Weitere Protokolle für andere Polymerasen oder fortgeschrittene PCR-Techniken finden Sie im Protokolle unseres Leitfadens PCR-Technologien.

Erfahren Sie mehr über die Standard-PCR, unter anderem was sie ist, auf unserer PCR-Grundlagen-Seite.

Reagenzien: Was wird für die PCR benötigt?

Reagenzien für die PCR	Empfohlenes Produkt
Taq DNA-Polymerase	Wählen Sie Taq DNA-Polymerase je nach Präferenz des Benutzers. (Siehe separate Taq polymerase Tabelle unten.)
PCR grade water	PCR Reagent Water
Primere auf Arbeitskonzentration verdünnt	10 µM Arbeitsvorräte sind für die meisten Assays ausreichend.
Oligos	Benutzerdefinierte Oligos
Zu vervielfältigende DNA	Vom Forscher zur Verfügung gestellt
Zweckpipetten
Thermocycler	Mit verschiedenen Wellblockgrößen oder im Multiformat
Sterile Filterpipettenspitzen
Sterile 1.5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss	Corning® Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss
PCR-Röhrchen oder -Platten	Auswahl passend zum Cycler:
	einzelne dünnwandige 200 µL PCR-Gefäße
	200 µL Streifengefäße
	Multiwell-Platten und Plattenverschluss
dNTP-Mischung	Deoxynukleotid-Mischung mit je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP *Readymixe enthalten bereits dNTPs

Was ist Taq Polymerase?

Taq DNA-Polymerase ist ein thermostabiles Enzym, das aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammt. Es wird üblicherweise zur Amplifikation von DNA-Fragmenten in der PCR verwendet. Das Enzym liegt in einer rekombinanten Form vor, die in E. coli exprimiert wird. Es ist in der Lage, wiederholtes Erhitzen auf 95 °C (wie es bei der PCR-Technik erforderlich ist) ohne nennenswerten Aktivitätsverlust zu überstehen. Das Enzym hat ein Molekulargewicht von ca. 94 kDa (SDS-PAGE) und weist keine nachweisbare Endonuklease- oder Exonuklease-Aktivität auf. Es besitzt 5'→3' DNA-Polymerase-Aktivität und 5'→3' Exonuklease-Aktivität. Jede Charge von Taq DNA-Polymerase wird für die PCR-Amplifikation und die doppelsträngige Sequenzierung getestet. Das Enzym wird in 5 Einheiten/µL geliefert und wird mit einem optimierten 10x Reaktionspuffer geliefert.

Standard Taq DNA-Polymerase

Nutzen Sie die folgende Tabelle, um eine geeignete Mischung von Taq DNA-Polymerase für Ihre Reaktionsbedingungen auszuwählen. Wählen Sie aus klaren oder rot gefärbten Formulierungen mit und ohne Magnesiumchlorid (MgCl₂) oder einem vorgefertigten Readymix oder Master-Mix mit Puffer und dNTPs.

MgCl2 enthaltend		Separate MgCl2	Readymix                 &nbspnbsp;
Klare Formulierung ohne Farbstoff	Mit rotem Farbstoff zur direkten Belastung von Gelen	Klare Formulierung ohne Farbstoff	Mit rotem Farbstoff zur direkten Beladung von Gelen	Klare Formulierung ohne Farbstoff
Taq DNA Polymerase von Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® DNA Polymerase (D4309)	Taq DNA Polymerase aus Thermus aquaticus, ohne MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ PCR-Reaktionsmix (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR-Reaktionsmix (P4600)

Einheitsdefinition: Eine Einheit baut 10 nmol der gesamten Desoxyribonukleosidtriphosphate in 30 Minuten bei 74 °C in säurefällbare DNA ein.

Ablauf: Schritte der PCR

Die optimalen Bedingungen für die Konzentration von Taq-DNA-Polymerase, Template-DNA, Primern und MgCl₂ hängen von dem verwendeten System ab. Es kann notwendig sein, die optimalen Bedingungen für jede einzelne Komponente zu bestimmen. Dies gilt insbesondere für die Taq-DNA-Polymerase, die Zyklusparameter und die MgCl₂-Konzentration. Es wird empfohlen, das Enzym und die MgCl₂-Konzentration zu titrieren, um die optimale Effizienz zu bestimmen.

1. Geben Sie die Reagenzien in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge in ein Röhrchen geeigneter Größe. (Wählen Sie die entsprechende Tabelle für den Reaktionsaufbau: Standard- oder Fertigmischungsreagenz.) Für eine große Anzahl von Reaktionen sollte eine Mastermischung ohne das Template erstellt und in Reaktionsröhrchen aliquotiert werden. Am Ende sollte die Vorlage in die entsprechenden Gefäße gegeben werden.
   

Standard PCR-Reaktion

Menge	Komponente	Endkonzentration
w µL	Wasser
5 µL	10x PCR Puffer (P2192 oder P2317)*	1x
1 µL	Deoxynukleotid-Mix	200 µM
w µL	Vorwärtsprimer (typischerweise 15-30 Basen lang)	0.1-0.5 µM
x µL	Reverse Primer (typischerweise 15-30 Basen lang)	0.1-0.5 µM
0.5 µL	Taq DNA Polymerase*	0.05 Einheiten/µL
y µL	Template DNA (typischerweise 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2 (nur in Verbindung mit Puffer P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Gesamtreaktionsvolumen

*Puffer und Taq Polymerase zusammen kaufen: D1806, D4309 oder D4545

Readymix PCR-Reaktion

Menge	Komponente	Endkonzentration
25 µL	Readymix (R2523 oder P4600)
w µL	Vorwärtsprimer (typischerweise 15-30 Basen lang)	0.1-0.5 µM
x µL	Reverse Primer (typischerweise 15-30 Basen lang)	0.1-0.5 µM
y µL	Template DNA (typischerweise 10 ng)	200 pg/µL
z µL	Wasser
50 µL	Gesamtreaktionsvolumen

2. Mixen Sie vorsichtig mit dem Vortex und zentrifugieren Sie kurz, um alle Komponenten am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Hinweis: Geben Sie 50 µL Mineralöl oben auf jedes Röhrchen, um die Verdunstung zu verhindern, wenn Sie einen Thermocycler ohne beheizten Deckel verwenden.

3. Amplifizieren. Die Amplifikationsparameter hängen von den verwendeten Primern und dem Thermocycler ab. Es kann notwendig sein, das System für einzelne Primer, Templates und Thermocycler zu optimieren.

Typische Cycling-Parameter

Empfohlen werden 25-30 Amplifikationszyklen.

PCR-Schritt	Temperatur °C	Dauer
Denaturvorlage	94 °C	1 min
Primer aushärten	55 °C	2 min
Ausdehnung	72 °C br>	3 min

4. Die amplifizierte DNA kann durch Agarosegel-Elektrophorese und anschließender Ethidiumbromid-Färbung.

      Hinweis: Mineralölüberlagerungen können durch eine einfache Chloroform-Extraktion (1:1) entfernt werden, wobei die wässrige Phase zurückgewonnen wird.

Reagenzien für die Nukleinsäure-Elektrophorese

• Agarose (vorgefertigte Gele, Pulver, etc.)
• Puffer wie MOPS-EDTA-Natriumacetat, Tris-Acetat-EDTA (TAE) oder Tris-Borat-EDTA (TBE)
• Gel-Ladelösung und Proben-Ladepuffer für RNA
• Elektrophorese-Färbemittel oder Farbstoff wie Ethidiumbromid

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

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Materialien

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