DNA-Oligonukleotid-Synthese

Die Phosphoramidit-Chemie, die in den 1980er Jahren entwickelt und später durch Festphasenträger und Automatisierung verbessert wurde, ist die Methode der Wahl für die Herstellung von DNA-Oligonukleotiden. Im Gegensatz zur Biosynthese verläuft die chemische Synthese in der Richtung 3' → 5' gemäß den in Abbildung 1 dargestellten Schritten. Hinweis: Dieser Artikel befasst sich ausschließlich mit der DNA-Synthese (obwohl sie ähnlich ist, gibt es Unterschiede zur chemischen Synthese von RNA). 

• Oligonukleotid-Synthese Phosphoramidit-Methode
• Abspaltung
• Entschützung
• Ausbeute

Abbildung 1. Zusammenfassung des Zyklus der Festphasen-Oligonukleotidsynthese. In Schritt 1, der Detritylierung, wird die 5'-DMT-Schutzgruppe vom ersten, auf einem festen Träger gebundenen Nukleosid, entfernt. In Schritt 2, der Kupplung, greift das freie 5'-OH des ersten, festphasengebundenen Nukleosids den Phosphor des ankommenden zweiten Nukleosids an und verdrängt dessen Diisopropylaminogruppe. In Schritt 3, der Oxidation, wird der instabile Phosphit-Triester in einen stabilen Phosphat-Triester umgewandelt, sodass der nächste Zyklus mit Schritt 1, der Detritylierung des zweiten Nukleotids, fortgesetzt werden kann. Bevor jedoch zum nächsten Zyklus übergegangen wird, werden in Schritt 4, dem Capping, die festphasengebundenen Nukleoside mit nicht reagierendem 5'-OH acetyliert, wodurch die Verlängerung von Sequenzen mit Deletionsmutationen verhindert wird (das Capping wird nach der Oxidation durchgeführt, um das gesamte Wasser zu verdrängen, das andernfalls den nächsten Zyklus der Reaktion hemmen würde).

Oligonukleotid-Synthese Phosphoramidit-Methode

In diesem Abschnitt wird die Chemie jedes der vier Schritte [Schritt 1 (Detritylierung), Schritt 2 (Kupplung), Schritt 3 (Capping) und Schritt 4 (Oxidation)] der Phosphoramidit-Methode im Detail untersucht.

Schritt 1 (Detritylierung)

Der Zyklus wird durch die Entfernung der 5'-DMT (4,4'-Dimethoxytrityl)-Schutzgruppe des festphasengebundenen Nukleosids (enthält die endständige 3'-Base des Oligonukleotids) eingeleitet. Das 5'-DMT verhindert die Polymerisation des Nukleosids während der Funktionalisierung des festen Trägerharzes. Der Mechanismus ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2. Mechanismus der Detritylierung. Die 5'-DMT-Schutzgruppe wird durch TCA (Trichloressigsäure) im Lösungsmittel Dichlormethan entfernt (eine zu konzentrierte TCA-Lösung oder eine zu lange Detritylierungszeit führt zu einer Depurinierung und verringert somit die Gesamtausbeute des fertigen Oligonukleotids). Die Produkte umfassen das endständige 3'-Nukleosid mit einem freien 5'-OH und einem DMT-Carbokation (Resonanzstruktur, die durch Elektronen-Delokalisierung gebildet wird, nicht dargestellt). Das Nukleosid geht zu Schritt 2 der Synthese über, während das DMT-Carbokation bei 495 nm absorbiert und dadurch die Farbe orange erzeugt, die zur Überwachung der Kupplungseffizienz verwendet werden kann.

Schritt 2 (Kupplung)

Sobald das DMT entfernt ist, kann das freie 5'-OH des festphasengebundenen Nukleosids mit dem nächsten Nukleosid reagieren, das als Phosphoramidit-Monomer hinzugefügt wird. Der Mechanismus ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3. Der Kupplungsmechanismus. Die Diisopropylaminogruppe des eingehenden Phosphoramidit-Monomers wird im Lösungsmittel Acetonitril durch den sauren Katalysator ETT [5-(Ethylthio)-1H-Tetrazol] "aktiviert" (protoniert). Das Mischen erfolgt in den Flüssigkeitsleitungen des Synthesegeräts, während die Reagenzien auf die Festphase geleitet werden. Das aktivierte Phosphoramidit wird in einem vielfachen Überschuss gegenüber dem festphasengebundenen Nukleosid zugeführt, um die Reaktion so weit wie möglich zu vervollständigen. Die Produkte umfassen ein Dinukleosid mit einer Phosphit-Triester-Bindung und einer freien Diisopropylaminogruppe.

Schritt 3 (Oxidation)

Der bei der Kupplungsreaktion gebildete Phosphit-Triester ist unnatürlich und instabil; er muss daher vor dem Beginn des nächsten Zyklus in eine stabilere Phosphorspezies umgewandelt werden. Durch Oxidation wird der Phosphit-Triester in den stabilen Phosphat-Triester umgewandelt. Der Mechanismus ist in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4. Der Oxidationsmechanismus. Die Oxidation des Phosphit-Triesters erfolgt mit Iod in Gegenwart von Wasser und Pyridin. Das Produkt ist der Phosphat-Triester, der im Wesentlichen ein Standard-DNA-Grundgerüst mit einer β-Cyanoethyl-Schutzgruppe am freien Sauerstoff ist.

Schritt 4 (Capping)

Da eine 100%ige Kupplungseffizienz nicht möglich ist, gibt es immer einige festphasengebundene Nukleoside mit nicht umgesetztem 5'-OH. Wenn sie nicht blockiert werden, reagieren diese Hydroxylgruppen im nächsten Zyklus und führen so zu einer fehlenden Base. Die Anhäufung dieser Deletionsmutationen durch aufeinanderfolgende Zyklen würde zu einer komplexen Mischung von "Shortmers" führen, die schwer aufzureinigen sind und daher das Oligonukleotid in der nachfolgenden Anwendung unbrauchbar machen könnten. Um die Anhäufung von Shortmers zu verhindern, ist ein Capping erforderlich. Der Mechanismus ist in Abbildung 5 dargestellt.

Abbildung 5. Der Capping-Mechanismus Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol reagieren im Lösungsmittel Tetrahydrofuran, das eine geringe Menge Pyridin enthält, zu einem Zwischenprodukt. Das Mischen erfolgt in den Flüssigkeitsleitungen des Synthesegeräts, während die Reagenzien auf die Festphase geleitet werden. Das Produkt ist das festphasengebundene Nukleosid mit einem acetylierten 5'-OH (Pyridin hält einen basischen pH-Wert aufrecht und verhindert so die Detritylierung des Phosphoramidit-Monomers durch das freie Acetat / die Essigsäure).

Aufeinanderfolgende Zyklen

Der zweite Zyklus beginnt mit Schritt 1, der Detritylierung, gefolgt von jedem der übrigen drei Schritte. Die Anzahl der wiederholten Zyklen entspricht der gewünschten Anzahl von Basen. Wir synthetisieren Oligonukleotide von 2 bis 120 Basen.

Abspaltung

Unser proprietäres festphasengebundenes Nukleosid ist gegenüber allen Phosphoramidit-Reagenzien stabil, kann aber am Ende der Synthese vom Oligonukleotid abgespalten werden. Die Abspaltung ist notwendig, damit das freie 3'-OH an biochemischen Reaktionen teilnehmen kann, z. B. an der Verlängerung durch DNA-Polymerase während der PCR, wenn das Oligonukleotid als Primer dient. Der Reaktant und das Produkt sind in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6. Der Reaktant und das Spaltprodukt. Die Esterhydrolyse des Linkers (und die gleichzeitige Entfernung der Festphase) erfolgt durch Behandlung mit konzentriertem wässrigem Ammoniak. Das Produkt ist das Oligonukleotid mit einem endständigen, freien 3'-OH.

Entschützung

Nach der Spaltung wird die Lösung des Oligonukleotids in konzentriertem wässrigem Ammoniak erwärmt, um die Schutzgruppen von den Basen und Phosphaten zu entfernen.

Basen

Während Thymin keine Schutzgruppe benötigt, ist dies bei Adenin, Cytosin und Guanin der Fall, da sie exozyklische primäre Aminogruppen enthalten. Die Schutzgruppen müssen entfernt werden, damit sich entsprechende Wasserstoffbrücken zwischen dem Oligonukleotid und der Zielnukleinsäure bilden können. Der Reaktant und das Produkt sind in Abbildung 7 dargestellt.

Abbildung 7. Der Reaktant und das Produkt der Basenentschützung. Das Oligonukleotid wird in konzentriertem wässrigem Ammoniak erwärmt. Zu den Schutzgruppen gehören: N(6)-Benzoyl A, N(4)-Benzoyl C und N(2)-Isobutyryl G. Das Reaktionsprodukt sind vollständig entschützte A-, C- und G-Basen.

Zusätzlich zu den Standard-Schutzgruppen können die labilen Dimethylformamidyl-G- und die "ultramilden" Schutzgruppen für modifizierte Oligonukleotide verwendet werden, die empfindlich auf Ammoniak reagieren. Diese Schutzgruppen auf den entsprechenden Basen sind in Abbildung 8 dargestellt.

Abbildung 8. Labile und ultramilde Schutzgruppen Die Dimethylformamidyl-Schutzgruppe wird in der Regel in konzentriertem wässrigem Ammoniak durch Erwärmen entfernt, allerdings in wesentlich kürzerer Zeit als die Isobutyrylgruppe. Zu den ultramilden Schutzgruppen gehören: N(6)-Phenoxyacetyl A, N(2)-Acetyl C und N(2)-Isopropylphenoxyacetyl G. Sie werden in der Regel bei Raumtemperatur in einer konzentrierten wässrigen Ammoniak/Methylamin-Lösung entfernt.

Bildung von Phosphodiester

Die β-Cyanoethylgruppe am freien Sauerstoff des Phosphats muss entfernt werden, um es von einem Phosphat-Triester in einen Phosphat-Diester (Phosphodiester) umzuwandeln. Der Mechanismus ist in Abbildung 9 dargestellt.

Abbildung 9. Der Mechanismus der Phosphodiesterbildung durch Entschützung. Die Cyanoethylgruppen werden in konzentriertem wässrigem Ammoniak durch β-Eliminierung entfernt. Die Reaktion verläuft schnell, da die Wasserstoffatome am Kohlenstoff neben der benachbarten elektronenentziehenden Cyanogruppe stark sauer sind. Produkte sind das Oligonukleotid mit nativem Phosphodiester-Grundgerüst und Acrylnitril.

Ausbeute

Die Ausbeute der Synthese hängt stark von der Kupplungseffizienz ab. Selbst bei einer Effizienz von 99,5 %, die wir problemlos erreichen, wird in Tabelle 1 ersichtlich, dass die Ausbeute mit zunehmender Oligonukleotidlänge rasch abnimmt.

Tabelle 1. Ausbeute, Länge und KupplungseffizienzDie Ausbeute nach Länge lässt sich mit Hilfe der Formel für die Kupplungseffizienz bestimmen: Y=CEN [diese Formel gilt für den von uns verwendeten Universalträger; bei basenspezifischen Trägern wäre es Y=CEN-1 (Y = Ausbeute; CE = Kupplungseffizienz; und N = Oligonukleotidlänge)]. Selbst bei einer Kupplungseffizienz von 99,5 % liegt die praktische Syntheselänge normalerweise bei 120 Basen, um eine Ausbeute von 50 % zu erreichen.

Länge (Basen)	Kupplungseffizienz
	90,00 %	95,00 %	97,00 %	98,50 %	99,50 %
10	34,90 %	59,90 %	73,70 %	86,00 %	95,10 %
20	12,20 %	35,80 %	54,40 %	73,90 %	90,50 %
50	0,52 %	7,70 %	21,80 %	47,00 %	77,80 %
100	0 %	0,59 %	4,80 %	22,10 %	60,60 %
150	0 %	0 %	1,00 %	10,40 %	47,10 %
200	0 %	0 %	0,23 %	4,90 %	36,70 %

Es ist wichtig, zu verdeutlichen, dass die Kupplungseffizienz nicht der einzige Faktor ist, durch den die Ausbeute bestimmt wird. Entschützung, Abspaltung und Aufreinigung (selbst einfache Entsalzung) verringern die Ausbeute weiter. Unsere garantierten Ausbeuten auf der Grundlage von Produktionsmaßstab und Aufreinigung finden Sie hier.