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# qPCR

Bei der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) werden fluoreszierende Reportermoleküle verwendet, um die Quantifizierung der amplifizierten Produkte zu ermöglichen. Wie bei der herkömmlichen PCR wird eine DNA-, cDNA- oder RNA-Matrize amplifiziert, jedoch werden in jedem Zyklus Fluoreszenzsignale zur relativen oder absoluten Quantifizierung erfasst.
Diese Technik ist für zahlreiche Forschungsbereiche nützlich, darunter Genexpressionsanalyse, Genotypisierung, microRNA-Analyse, Analyse genetischer Variationen und Proteinanalyse.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist aus molekularbiologischen Labors nicht mehr wegzudenken. Die PCR dient der Vervielfältigung von DNA um mehrere Größenordnungen, und unsere Reagenzien und Ressourcen eignen sich für zahlreiche Forschungsabläufe, darunter Genexpressionsanalysen, Genotypisierung, Sequenzierung und Mutagenese.
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Übersicht
Verwandte Artikel und Protokolle
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## So analysieren Sie qPCR-Daten
Die Fluoreszenz der Reportermoleküle wird gemessen und quantifiziert; typischerweise handelt es sich dabei entweder um Farbstoffe (z. B. SYBR® Green, Ethidiumbromid), die sich zwischen die Basen der doppelsträngigen DNA einlagern, oder um Sonden, die so konzipiert sind, dass sie an eine bestimmte Sequenz (z. B. Molecular Beacons, TaqMan®-Sonden) auf der DNA binden.
## Relative Quantifizierung von qPCR-Daten
Es gibt zwei wichtige Quantifizierungsmethoden für qPCR-Daten. Die relative Quantifizierung, die gängigere Methode, nutzt ΔΔCt-Informationen, anhand derer das Expressions- oder Abundanzverhältnis des Zielgens in der Probe im Vergleich zu einem Kontrollgen bestimmt und anhand des Expressionsverhältnisses eines Referenzgens normalisiert wird. Da sich die Effizienzwerte E für Ziel- und Referenzgene unterscheiden, berücksichtigt diese Methode auch die Unterschiede bei den E-Werten. Diese Methode wird häufiger in der Genexpressionsanalyse eingesetzt.
## Absolute Quantifizierung von qPCR-Daten
Die zweite Methode, die absolute Quantifizierung, ist in der Umweltmikrobiologie gebräuchlicher und nutzt die Standardkurve (SC). Bei der SC-Methode werden Verdünnungsreihen mit bekannter Template-Konzentration N₀ verwendet, um mittels linearer Regression von log(N₀) gegen den CT-Wert (Threshold Cycle) eine Standardkurve zu erstellen. Diese wird dann zur Berechnung der Template-Konzentrationen der Probe herangezogen. Die Methode basiert auf der Annahme, dass der Effizienzwert der Probe dem des Standards entspricht.
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Der Zweck der Hot-Start-PCR besteht darin, die PCR-Reaktion zu hemmen, um die unspezifische Amplifikation zu reduzieren, die Bildung von Primer-Dimeren zu verhindern und die Produktausbeute zu erhöhen.
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Die quantitative Echtzeit-PCR für Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-qPCR) wird häufig in Studien eingesetzt, die sich auf spezifische Gene und potenzielle regulatorische Regionen unter verschiedenen Versuchsbedingungen und bei der Datenanalyse konzentrieren. qPCR ermöglicht die DNA-Analyse in Echtzeit durch die Analyse von Fluoreszenzsignalintensitäten, die proportional zur Amplikonmenge sind.
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Das Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration ist ein Ansatz zur Erstellung einer Reaktionsmatrix. Sie wird verwendet, um eine Reihe von Konzentrationen für jeden Primer im Abgleich zu verschiedenen Konzentrationen des Partnerprimers zu testen.
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Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.
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In der RT-qPCR oder quantitativen PCR mit reverser Transkription werden die Effekte der reversen Transkription und der quantitativen PCR oder Echtzeit-PCR für die Amplifikation und den Nachweis spezifischer Ziele kombiniert. Die RT-qPCR wird in vielen Anwendungen eingesetzt, darunter die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus, die Validierung der RNA-Interferenz (RNAi) und der Nachweis von Krankheitserregern wie Viren.
[Funktionsweise der qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/CH/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/how-qpcr-works)
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