Herstellungsstrategien für mRNA-Impfstoffe und -Therapeutika

Angesichts der verkürzten Zeitspanne von der Entwicklung bis zur klinischen Anwendung ist die mRNA-Technologie vielversprechend – nicht nur als schnelles und wirksames Mittel zur Bekämpfung von Infektionskrankheitsausbrüchen, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten mit ungedecktem Bedarf. mRNA-Technologien bieten zahlreiche Vorteile: ein ausgezeichnetes Sicherheitsprofil, ein hohes Maß an Vielseitigkeit und einen standardisierten Herstellungsprozess.

Angesichts der frühen Erfolge von mRNA-Impfstoffen sind die heutigen mRNA-Hersteller bestrebt, die Effizienz und Produktivität ihrer Produktionsprozesse zu steigern, indem sie die Stabilität der mRNA verbessern und Strategien umsetzen, die die Reinigung von pDNA und mRNA optimieren sowie die Skalierung auf die GMP-konforme Produktion ermöglichen.

Sehen Sie sich alle unsere Produkte und Dienstleistungen für die mRNA-Entwicklung und -Herstellung an.

Übersicht über den Abschnitt

• Überlegungen zur mRNA-Herstellung
• Herstellung von mRNA
• Reinigung von mRNA
• Überlegungen zur Skalierung

Überlegungen zur Herstellung von mRNA

Die Herstellung von mRNA-Impfstoffen und -Therapeutika folgt in der Regel einem standardisierten Verfahren (Abbildung 1). Diese vereinfachte Herstellungsvorlage verwendet für jedes Zielmolekül dieselben Reaktionsmaterialien und ermöglicht es mRNA-Herstellern, neue Zielmoleküle mit minimalen Prozessanpassungen zu produzieren.

Abbildung 1. Allgemeiner Prozessüberblick zur Herstellung von mRNA.

Mehrere wichtige Entscheidungen haben einen überproportionalen Einfluss auf den Prozess, die Ausbeute und die Qualität des endgültigen mRNA-Produkts; eine davon ist die Qualität der Prozesschemikalien und Rohstoffe. Insbesondere während der In-vitro-Transkription und der anschließenden Reinigung ist die mRNA ungeschützt und einem hohen Risiko des enzymatischen Abbaus ausgesetzt. Die Verwendung hochwertiger Chemikalien, die auf das Fehlen von Endonukleaseaktivität geprüft wurden, minimiert das Risiko eines RNase-induzierten Abbaus und verbessert die Stabilität der mRNA während der gesamten Reinigung und Formulierung des mRNA-Arzneimittels.

Diese Webseite hilft Ihnen, diese und andere Herausforderungen zu meistern, indem sie Informationen zu unseren umfassenden, integrierten Lösungen bereitstellt, die darauf ausgelegt sind, Ihre mRNA-Herstellung zu optimieren. Unsere Broschüre „Prozesschemikalien für die Herstellung von mRNA-Arzneimitteln“ enthält die Details, die Sie benötigen, um fundierte Entscheidungen zu treffen.

mRNA: Strukturelle Elemente und ihre Funktionen

Das mRNA-Konstrukt ist so konzipiert, dass eine effiziente Expression des Zielgens gewährleistet ist. Stabilität, Genexpression und effiziente Proteinbiosynthese hängen von mehreren Strukturelementen ab (Abbildung 2):

Abbildung 2. mRNA-Struktur.

• Cap-Region am 5'-Ende der Sequenz: Unverzichtbar für die Reifung der mRNA, die Erkennung durch das Ribosom für eine effiziente Proteinbiosynthese und den Schutz vor Nukleaseabbau zur Verbesserung der Stabilität.
• Untranslatierte Regionen (UTRs) an den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Domänen der mRNA-Kodierungsregion: Regulieren die mRNA-Translation, Lokalisierung und Stabilität; können zur Verbesserung der Proteinexpressionseffizienz genutzt werden.
• Offener Leserahmen oder kodierende Sequenzregion: Enthält das Zielgen (GOI).
• Poly(A)-Schwanz: Entscheidend für die Proteintranslation und die mRNA-Stabilität, da er den Abbau durch die 3'-Exonuklease verhindert.

Herstellung von mRNA

Die Herstellung von mRNA-basierten Therapeutika und Impfstoffen beginnt mit einer Plasmid-DNA-Matrize (pDNA), die anschließend linearisiert und in mRNA transkribiert wird.

• pDNA-Herstellung: Die pDNA-Matrize enthält einen Promotor für die DNA-abhängige RNA-Polymerase sowie die Sequenz für das mRNA-Konstrukt. Die pDNA wird in Bakterienzellen amplifiziert, die anschließend geerntet und lysiert werden, um die zirkuläre pDNA freizusetzen. Dieses Lysat ist extrem viskos, da es die pDNA und andere große, negativ geladene Verunreinigungen wie RNA, genomische DNA und Endotoxine aus den Bakterienzellen enthält, was die Reinigung erschwert.
• pDNA-Reinigung: Die Reinigung der pDNA-Matrize von Verunreinigungen sollte eine maximale Trennung gewährleisten und gleichzeitig das Risiko einer mechanischen Beschädigung der Plasmid-Matrize minimieren. Die gereinigte, zirkuläre pDNA wird anschließend linearisiert, um Transkriptions-Readthrough-Ereignisse zu vermeiden, die unerwünschte mRNA-Sequenzvarianten erzeugen könnten, die entfernt werden müssten.¹ Diese linearisierte pDNA-Matrize wird weiter gereinigt, um Verunreinigungen wie das zur Linearisierung verwendete Restriktionsenzym, Rinderserumalbumin (BSA), DNA-Fragmente und Endotoxine zu entfernen. Da die pDNA-Matrize typischerweise in Bakterienzellen hergestellt wird, stellen Endotoxinverunreinigungen eine kritische Verunreinigung dar, die nachfolgende Reinigungsschritte beeinträchtigt. Detergenzien wie das Deviron^® C16-Detergens können zur effektiven Entfernung von Endotoxinen eingesetzt werden und sind eine nachhaltige, biologisch abbaubare und REACH-konforme Alternative zu herkömmlichen Detergenzien.²

Es bestehen deutliche Unterschiede im Ansatz zur pDNA-Reinigung im Labormaßstab und im GMP-Produktionsmaßstab. Bei Verfahren im Labormaßstab werden häufig Lösungsmittelextraktionstechniken eingesetzt, um pDNA von anderen Komponenten zu trennen, doch die Handhabung und Entsorgung dieser Chemikalien im großen Maßstab kann eine Herausforderung darstellen. Im Gegensatz dazu werden in GMP-Produktionsumgebungen typischerweise Tangentialflussfiltration (TFF) und Chromatographie zur effizienten Entfernung von Verunreinigungen eingesetzt. 

In-vitro-Transkription (IVT): Die linearisierte und gereinigte pDNA wird anschließend in einer enzymatischen Reaktion in mRNA transkribiert.

• Zu den kritischen Komponenten für die In-vitro-Transkription gehören die RNA-Polymerase, die die Transkription von DNA in mRNA katalysiert; Ribonukleosidtriphosphate (rNTPs), die als Bausteine der mRNA dienen; anorganische Pyrophosphatase (IPP), die die mRNA-Ausbeute erhöht; sowie RNase-Inhibitoren, die den RNA-Abbau verhindern. Der Transkriptionspuffer enthält typischerweise Dithiothreitol (DTT), um Disulfidbrücken zu reduzieren und die RNase-Aktivität zu hemmen, während Spermidin zur Verbesserung der Transkriptionseffizienz und zur Stabilisierung der Nukleinsäuren beigemischt wird. Um das Risiko eines enzymatischen Abbaus in diesem kritischen Prozessschritt zu minimieren, ist es unerlässlich, Chemikalien auszuwählen, die auf das Fehlen von Endonukleaseaktivität getestet wurden. Einen umfassenden Überblick über unsere hochwertigen Chemikalien und Hilfsstoffe, einschließlich eines breiten Portfolios an endonukleasefreien Produkten, finden Sie in unserer Broschüre „Prozesschemikalien für die Herstellung von mRNA-Arzneimitteln“.
• Überwachung der Transkription: Während der IVT-Reaktion sollten kritische Prozessparameter (CPPs) überwacht werden, um kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) zu kontrollieren und eine optimale Verarbeitung sicherzustellen. Eine effektive Überwachung ermöglicht eine besser kontrollierte Herstellung und schnellere Reaktionen auf Prozessschwankungen. 

Capping: Nach der Transkription wird dem mRNA-Transkript eine 5'-Cap-Struktur hinzugefügt, um die Stabilität und die Transduktion in der Wirtszelle zu verbessern. Das Cap kann auf zwei Arten hinzugefügt werden:

• Co-transkriptionelles Capping: wird während des IVT-Schritts durchgeführt. Allerdings sind Effizienz und Ausbeute gering, und dieser Ansatz kann aufgrund falscher Bindung oder umgekehrter Einbindung zu nicht-capped Verunreinigungen führen.
• Das enzymatische Capping (oder posttranslationale Capping) wird nach der mRNA-Reinigung durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird in der Regel ein Capping-Enzym verwendet, um die Cap an die gereinigte mRNA anzuhängen. Dieser Ansatz ist zwar effizienter, jedoch teurer und stellt einen zusätzlichen Verarbeitungsschritt nach der Reinigung dar.

Reinigung von mRNA

Nach der In-vitro-Transkription wird die mRNA von den in den vorherigen Schritten verwendeten Verunreinigungen und Materialien gereinigt, darunter Endotoxine, immunogene doppelsträngige RNA (dsRNA), restliche DNA-Matrizen, RNA-Polymerase und elementare Verunreinigungen. Für die Reinigung der mRNA und die Entfernung von restlicher DNA stehen mehrere Optionen zur Verfügung.

Chromatographische Trennungen wie die Umkehrphasen-Ionenpaar-Chromatographie (IPRP), die Anionenaustauschchromatographie (AEX) und die Affinitätschromatographie (AC) unter Verwendung von Poly(dT)-Capture (Abbildung 3) reinigen das mRNA-Ziel effizient und entfernen die DNA-Matrize, wodurch die Notwendigkeit einer DNA-Verdauung entfällt1^{, 3}. Die Chromatographie wird auch nach der enzymatischen Capping-Reaktion eingesetzt, um unerwünschte mRNA-Transkripte und Oligonukleotid-Verunreinigungen zu entfernen.

Abbildung 3: Vergleich von Umkehrphasen-Ionenpaar-, Anionenaustausch- und Affinitätschromatographie zur mRNA-Aufreinigung (DBC: dynamische Bindungskapazität).^4,5

• Die Ionenpaarungschromatographie mit Umkehrphase (IPRP) kann im kleinen Maßstab eingesetzt werden, um die gewünschte einzelsträngige RNA (ssRNA) effizient einzufangen und von Verunreinigungen zu trennen. Da diese Methode jedoch Lösungsmittel erfordert, ist sie für die GMP-konforme Herstellung weniger geeignet und eignet sich besser für die Reinigung als für die Anreicherung.
• Die Anionenaustauschchromatographie (AEX) verfügt über eine hohe dynamische Bindungskapazität und entfernt effizient Verunreinigungen wie dsRNA, ungekappte RNA, RNA-DNA-Hybride und andere RNA-Strukturen wie Haarnadel-mRNA. Während bei der AEX wässrige Lösungen verwendet werden, sind potenziell toxische chaotrope Mittel und Betriebstemperaturen von bis zu 85 °C erforderlich, um große, an das Harz gebundene mRNA-Moleküle zu desorbieren.
• Die Affinitätschromatographie (AC) mit Poly(dT)-Capture nutzt ein Harz, um den Poly(A)-Schwanz von mRNA-Transkripten voller Länge spezifisch einzufangen. Diese Methode entfernt effizient DNA, Nukleotide, Enzyme, Pufferkomponenten und alle anderen Verunreinigungen, die keinen Poly(A)-Schwanz aufweisen. Aus diesem Grund wird AC üblicherweise für den anfänglichen mRNA-Capture verwendet, gefolgt von AEX zur Reinigung.
• Nach den Chromatographieschritten erfolgt die Endkonzentration und Diafiltration, um die Produktreinheit zu maximieren und die mRNA in den geeigneten Puffer für die Formulierung oder Lagerung zu überführen.

Überlegungen zur Skalierung

Einwegtechnologien bieten Herstellern mit einer umfangreichen Pipeline an Zielmolekülen Skalierbarkeit, Anpassungsfähigkeit und Qualität und sind ein wesentlicher Faktor für viele GMP-konforme mRNA-Herstellungsprozesse. Die GMP-konforme Herstellung nutzt die Vorteile von TFF- oder Chromatographie-Schritten für eine effiziente Trennung im großen Maßstab und ersetzt damit alternative Reinigungsmethoden, die typischerweise bei der Prozessentwicklung im kleinen Maßstab zum Einsatz kommen. Zu berücksichtigende Aspekte sind unter anderem:

• TFF- oder Chromatographieschritte ersetzen die in der mRNA-Prozessentwicklung häufig verwendeten Lösungsmittelextraktions- und Fällungsschritte.
• Es müssen nach Möglichkeit hochwertige Chemikalien und endonukleasefreie Reagenzien verwendet werden, um die mRNA-Stabilität zu verbessern und die Möglichkeit eines mRNA-Abbaus zu minimieren.

In den letzten Jahren wurden große Erfolge bei der Einführung von mRNA-Impfstoffen für große Patientengruppen erzielt. Obwohl weiterhin Herausforderungen bestehen, hat der Fokus auf die Maximierung der mRNA-Stabilität durch den Einsatz hochwertiger Chemikalien und endonukleasefreier Reagenzien sowie die Optimierung und Anpassung chromatographischer Reinigungstechnologien zur Maximierung der Trennung und zur Rationalisierung der Skalierung zu erheblichen Fortschritten bei den GMP-Herstellungsvorlagen geführt.  

Damit die mRNA-Technologie ihr volles Potenzial entfalten kann, sind innovative Lösungen, Fachwissen und Einfallsreichtum gefragt, um die Entwicklung robuster Plattformen im Produktionsmaßstab sicherzustellen. Mit unseren Produkten, Dienstleistungen und unserem technischen Know-how setzen wir uns dafür ein, integrierte Lösungen zu entwickeln, die Ihre mRNA-Herstellung optimieren.

Literaturverzeichnis

1. Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Patent No. WO2014152031A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152031A1/en

2. Kiesewetter A, Gupta A, Heinen‐Kreuzig A, Greenhalgh T, Stein A. 2023. Improved endotoxin removal using ecofriendly detergents for intensified plasmid capture. Biotechnology Progress. 39(6): https://doi.org/10.1002/btpr.3375

3. Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en

4. Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en

5. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3