Séquençage

Séquençage de Sanger

Très tôt, les méthodes de chimie analytique ont permis de déterminer la composition des acides nucléiques. Cependant, Fred Sanger et ses collègues ont mis au point des méthodes – utilisant initialement des fragments digérés radiomarqués et un fractionnement bidimensionnel – qui ont permis d’obtenir certaines des premières séquences nucléiques complètes. Les progrès dans ce domaine se sont poursuivis pendant plusieurs décennies, chaque avancée venant enrichir une bibliothèque croissante de protéines et de génomes séquencés. Parmi ces avancées figurent la séparation des nucléotides en fonction de leur longueur par électrophorèse sur gel, suivie d’une électrophorèse capillaire. De plus, l’incorporation de nucléotides marqués par fluorescence et l’analyse informatisée automatisée de chaque fragment d’acide nucléique définissent désormais la méthode moderne de séquençage de Sanger.

Méthodologie du séquençage de l’ADN

Bien que les méthodes de séquençage de l’ADN n’aient cessé de s’améliorer depuis les débuts de cette technologie, plusieurs éléments fondamentaux restent indispensables et sont toujours utilisés par les plateformes modernes de séquençage de l’ADN. La préparation de l’ADN comprend généralement l’isolation et la purification de l’ADN à partir de l’organisme hôte. D’autres composants essentiels, notamment des bases d’ADN libres, des amorces d’ADN, des bases d’ADN modifiées contenant des marqueurs fluorescents (bases terminatrices) et de l’ADN polymérase, sont ajoutés ensemble dans un même récipient. Ce récipient, contenant tous ces composants, subit une série d’étapes de chauffage et de refroidissement qui permettent de produire une bibliothèque de petites séquences d’ADN par rapport à la séquence d’ADN complète d’intérêt, chacune se terminant par une base terminatrice marquée par fluorescence à son extrémité. Les nouveaux brins d’ADN contenant les nucléotides marqués par une étiquette fluorescente à l’extrémité sont séparés en fonction de leur longueur, acheminés à travers un tube capillaire et classés par taille. Un laser est ensuite utilisé pour exciter la base fluorescente sur chaque brin tandis qu’une caméra capture le signal. Enfin, un ordinateur est généralement utilisé pour assembler les informations recueillies en une séquence d’ADN complète.